Dans une étude récente publiée dans Pathogènes PLoSles chercheurs ont évalué l’impact du cadre de lecture ouvert (ORF)-6 du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2) sur la signalisation immunitaire innée.
Arrière plan
Un bêtacoronavirus appelé SRAS-CoV-2 est à l’origine de la maladie virale mortelle coronavirus 2019 (COVID-19). Comprendre la biologie moléculaire du virus et comment il interagit avec la cellule hôte est nécessaire de toute urgence en raison de son impact significatif sur la santé humaine. Neuf protéines accessoires putatives codées par le SRAS-CoV-2 sont considérées comme inutiles pour in vitro réplication et jouent probablement un rôle dans la modification du milieu de la cellule hôte pour favoriser la réplication virale.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont démontré que la protéine accessoire SARS-CoV-2 ORF6 interagissait avec l’exportation cellulaire d’acide ribonucléique 1 (Rae1) en empêchant l’exportation d’acide ribonucléique messager (ARNm).
L’équipe a d’abord créé un panel de particules de type virus (VLP) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 qui codent chaque ORF pour transduire une variété de lignées cellulaires différentes et induire l’expression de chaque protéine accessoire séparément pour examiner la fonction du SRAS -Protéines accessoires CoV-2. Des VLP ont été créés lorsque des cellules HEK293T ont été cotransfectées avec le VIH-1 Gag-Pol, VSV-G et un vecteur pLVX-StrepII-ORF contenant les gènes ORF3a, ORF3d, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, ORF9b, ORF9c ou ORF10.
Toutes les VLP avaient au moins 104 unités infectieuses/ml lorsque leurs titres ont été évalués après 72 heures, à l’exception de l’ORF6 qui code pour une VLP ayant des unités infectieuses indétectables. Les lysats de cellules HEK293T transfectées ont été examinés par immunotransfert de la polyprotéine structurelle du VIH-1, Gag, pour déterminer si cela était dû à une baisse de l’infectiosité ou à une réduction de la formation de particules.
L’équipe a ensuite produit des VLP du VIH-1 rapporteurs de protéine fluorescente verte (GFP) tout en augmentant les concentrations d’ORF6 ou d’ORF9b comme contrôle pour déterminer s’il y avait une influence dose-dépendante sur l’expression de Gag et la génération de VLP. L’immunotransfert a été utilisé pour examiner le VIH-1 Gag et ORF6/ORF9b dans des lysats de cellules HEK293T transfectées.
Les chercheurs ont également examiné l’effet de l’ORF6 sur l’expression de la protéine fluorescente MLV Gag et mApple car ils ont des séquences protéiques entièrement différentes de celles du VIH-1 Gag pour noter si la suppression de l’ORF6 n’était spécifique qu’à l’expression du VIH-1 Gag. Comme pour le VIH-1 Gag, l’expression de MLV Gag et la génération de VLP ont été supprimées par ORF6 de manière dose-dépendante.
L’étude a également surexprimé Rae1 avec HIV-1 Gag et ORF6 dans les cellules HEK293T pour tester l’hypothèse selon laquelle ORF6 pourrait inhiber l’expression des protéines en interagissant avec le complexe Rae1-Nup98. Pour maintenir les niveaux de protéines d’ORF6 cohérents avec les niveaux de Raël, l’étude a utilisé le vecteur d’expression ORF6 original dans ce cas. Des co-immunoprécipitations ont été menées pour vérifier la connexion d’ORF6 avec Rae1 et étudier la relation avec Nup98. Les plasmides codant pour la GFP ou ORF6 marquée par Strep avec Nup98 et/ou HA-Rae1 ont été co-transfectés dans des cellules HEK293T. Les cellules ont été lysées après 24 heures et un anticorps anti-Strep a été utilisé pour immunoprécipiter GFP ou ORF6.
Résultats
Toutes les cellules, à l’exception de celles transfectées avec pLVX-StrepII-ORF6, ont montré des signes de Gag. Cela indiquait que l’expression d’ORF6 empêchait la génération de VLP en inhibant la synthèse de Gag. Ce n’est que lorsque l’ORF6 était présent à des concentrations croissantes que l’expression de gag diminuait de manière dose-dépendante. L’équipe a vérifié que l’ORF6 produit à partir de ce vecteur réduisait considérablement l’infectivité virale et l’expression de Gag. Bien que l’immunotransfert ait démontré une très faible expression d’ORF3d, d’ORF9c et d’ORF10, ce que d’autres ont également vu, aucun des autres ORF n’a eu d’impact sur l’intensité de fluorescence médiane (MFI) de mApple. Au total, nos découvertes impliquent que l’ORF6 peut bloquer la production de plusieurs protéines produites par un vecteur.
L’équipe a également vérifié que l’ORF6 produit à partir de ce vecteur réduisait considérablement l’infectiosité virale et l’expression de Gag. De plus, lorsque le MFI de mApple a été évalué par cytométrie en flux après co-transfection de cellules HEK293T avec des plasmides exprimant chaque ORF du SRAS-CoV-2 dans le vecteur étiqueté à deux streptocoques, ORF6 a considérablement diminué le MFI par rapport au contrôle. Bien que l’immunotransfert ait démontré une très faible expression d’ORF3d, d’ORF9c et d’ORF10, ce que d’autres ont également vu, aucun des autres ORF n’a eu d’impact sur le MFI de mApple. Vus collectivement, nos résultats impliquent que l’ORF6 peut bloquer la production de plusieurs protéines produites par un vecteur.
Les cellules traitées à la leptomycine B (LMB) avaient également un rapport d’ARNm Nucl: Cyto GFP supérieur à celui des cellules non traitées, à 0, 93 et 0, 35, respectivement, même si les niveaux globaux d’ARN GFP étaient diminués. Les cellules exprimant ORF6 avaient notamment un rapport d’ARNm Nucl: Cyto GFP similaire aux cellules témoins exprimant ORF9b, reflétant la seule légère réduction de l’expression de GFP, tandis que les cellules exprimant ORF6 (LMB) augmentaient le rapport d’ARNm Nucl: Cyto GFP et réduisaient l’expression de GFP. Dans l’ensemble, les preuves suggèrent que l’ORF6 bloque l’exportation nucléaire dépendante de Rae1 de l’ARNm de la GFP.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont révélé un nouveau mécanisme que le SRAS-CoV-2 utilise pour manipuler l’environnement de la cellule hôte afin d’inhiber les défenses antivirales, ajoutant à notre connaissance des tactiques de reproduction virale qui ont conduit à la catastrophe sanitaire mondiale sans précédent.
