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La probabilité que la pandémie de COVID-19 ne s'atténue pas de sitôt a déclenché des recherches intensives sur sa détection et son traitement, afin de prévenir la transmission ultérieure. Un nouvel article de chercheurs de l'Université McMaster et de Hamilton Health Sciences, publié sur le serveur de pré-impression medRxiv* en septembre 2020, des rapports sur le développement d'un test sérologique adapté aux tests d'anticorps sensibles à haut débit pour COVID-19.
Sommaire
Détection du COVID-19 asymptomatique
Les symptômes du COVID-19 apparaissent généralement 2 à 14 jours après avoir été exposés au coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), mais de nombreuses personnes sont infectées de manière asymptomatique – en fait, jusqu'à 80% des cas ne présentent pas de symptômes. Étant donné que de tels cas entraînent la propagation du virus dans la moitié de toutes les infections connues, les tests sérologiques deviennent essentiels pour déterminer les taux d'infection réels.
Le test de diagnostic utilisé dans COVID-19 est une réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase en temps réel (RT PCR) dans laquelle le génome de l'ARN viral est amplifié pour permettre la détection. Cet acide nucléique viral est généralement obtenu à partir de prélèvements nasaux ou de gorge. Les chances d'obtenir un résultat positif précis de ces prélèvements sont les plus élevées dans les quatre jours précédant le début des symptômes. En fait, à partir du premier jour des symptômes, la détection de l'ARN est possible, avec un pic au cours de la première semaine d'infection. Cependant, à la semaine 3, les tests PCR commencent à devenir négatifs, sauf dans les cas graves. Une mise en garde est que la positivité de la PCR indique uniquement la présence d'ARN viral et non de virus viable ou infectieux. Ce test est sensible à environ 80% mais 100% spécifique.
Tests sérologiques
Il est évident que le dépistage du SRAS-CoV-2 est essentiel pour contenir la transmission virale, ce qui nécessite des méthodes de test très précises. Une de ces options est la sérologie, pour détecter une réponse immunitaire et ainsi aider à repérer ceux qui sont infectés parmi les contacts, identifier les donneurs potentiels de plasma en convalescence et évaluer l'efficacité du vaccin.
Les anticorps anti-SARS-CoV-2 indiquent que la personne a peut-être développé une immunité protectrice dirigée contre la glycoprotéine S à gros pic, composée de deux domaines, S1 et S2. Le premier contient le domaine de liaison au récepteur (RBD), qui est lié par la majorité des anticorps neutralisants se lient.
La protéine S existe dans la nature sous la forme d'un homotrimère, se liant à l'enzyme 2 de conversion de l'angiotensine (ACE2), récepteur de cellule humaine. Par la suite, la fusion virus-cellule est déclenchée, conduisant à l'entrée du virus dans la cellule hôte.
Des études antérieures indiquent des titres inférieurs d'anticorps IgG spécifiques chez les personnes atteintes d'une infection asymptomatique ou légère, mais des niveaux élevés chez ceux qui se sont rétablis d'un COVID-19 sévère.
Établissement d'un test à haut débit
L'étude actuelle décrit les résultats d'une nouvelle méthode de test utilisée sur dix patients convalescents positifs à la PCR, 4 individus négatifs à la PCR et 332 témoins pré-COVID. Tous les échantillons de patients ont été prélevés entre le jour 23 et le jour 89 de l'infection. Parmi les témoins, 26 étaient en bonne santé, tandis que 306 auraient un faible nombre de plaquettes, soit de nature immunitaire, soit en raison de l'utilisation d'héparine.
Les chercheurs ont ensuite développé un test ELISA pour la protéine S et RBD pleine longueur. Ils ont établi les concentrations optimales de RBD et de S à 2 µg / mL (figure 1A) et de protéine S à 5 µg / mL, en termes de caractérisation des valeurs positives et négatives. De même, la dilution optimale du sérum pour un seuil entre positif et négatif s'est avérée être de 1/100.
ELISA hautement réactifs et reproductibles
Les échantillons de convalescence étaient uniformément fortement réactifs aux deux antigènes, plus contre le S pleine longueur que le RBD. Les échantillons pré-COVID-19 étaient pour la plupart non réactifs. Ils ont découvert que les IgM anti-S et anti-RBD étaient les moins spécifiques et les IgA pour les deux antigènes, les plus spécifiques parmi tous les anticorps.
Ils ont également veillé à ce que les résultats du test soient reproductibles en répétant le test quatre fois ou plus, avec une variabilité minimale entre les tests. De nombreuses méthodes sont utilisées pour garantir la sécurité lors de la manipulation d'échantillons contaminés par des virus, comme le traitement thermique et le Triton X-100. Ils ont constaté que le traitement thermique affectait le taux de détection des IgG et des IgM. Cela pourrait être dû à la dénaturation et à l'agrégation des antigènes lors du chauffage. L'IgM a des structures de chaîne lourde qui la rendent plus vulnérable à l'instabilité thermique.
Le traitement avec Triton X-100 n'a eu aucun effet significatif sur la réactivité des échantillons dans les échantillons de patients. Les titres d'anticorps dans les titres pré-COVID-19 sont devenus plus élevés après le traitement par l'une ou l'autre de ces méthodes.
Inhibition de la liaison des IgG à la RBD
Les échantillons de patients COVID-19 se sont révélés uniformément présenter une inhibition de la liaison anti-RBD d'environ 80%, tout comme un témoin qui a été testé positif pour les IgG anti-RBD. La validation des dosages a été effectuée en utilisant des dosages disponibles dans le commerce.
Les chercheurs disent: «Nous décrivons une méthode sérologique semi-quantitative reproductible à haut débit pour détecter les anticorps contre le SRAS-CoV-2. » Le test mesure les trois types d'anticorps réactifs aux protéines virales S et RBD.
D'après des études antérieures, il est évident que tous les isotypes d'anticorps augmentent régulièrement, avec des pics à la fois d'IgA et d'IgM 1 à 3 semaines après l'infection, puis d'IgG. La capacité de mesurer les trois isotypes permet donc une visualisation plus large de la réponse immunitaire avec un risque plus faible de résultats faussement négatifs.
De plus, les antigènes S et RBD de pleine longueur ont été utilisés dans le test actuel. La spécificité de ces tests dépend de nombreux facteurs, y compris le type de test et d'antigène, ainsi que d'autres auto-anticorps hôtes tels que le facteur rhumatoïde et d'autres anticorps hétérophiles.
Réactivité croisée avec d'autres coronavirus
La réactivité croisée avec des antigènes d'autres coronavirus est également un facteur important qui a été identifié dans les kits ELISA SARS-CoV-2 disponibles dans le commerce et dans le test actuel. Les IgA semblent être les moins spécifiques parmi les anticorps COVID-19. Ainsi, la raison des résultats de test positifs dans 19 contrôles pré-COVID-19 peut être la réactivité croisée. Les chercheurs disent: «Les contrôles pré-COVID-19 qui avaient des anticorps anti-RBD n'étaient pas faux positifs en soi car la liaison de l'anticorps pouvait être inhibée par un excès de RBD. » Cela est très probablement dû à des anticorps à réaction croisée générés contre d'autres coronavirus saisonniers.
La spécificité est également une variable de la population témoin sélectionnée. Les chercheurs ont constaté qu'avec l'ELISA optimisé utilisé ici, la spécificité était de 94% ou plus en fonction de la classe d'anticorps et de l'antigène sélectionnés. Ces résultats sont également conformes à ceux rapportés en utilisant deux dosages commerciaux avec une sensibilité et une spécificité de 100% et 90%, respectivement. Dans certains articles antérieurs, cependant, ce dernier a été signalé comme ayant une sensibilité et une spécificité significativement plus faibles de 65% et 74%, respectivement.
Implications
Un avantage de l'approche de test ELISA actuelle est qu'elle est rapide et simple, sans avoir besoin d'instruments spécialisés. Il est capable d'être adapté aux laboratoires de diagnostic standard et est hautement reproductible entre les différents tests lorsque les tests sont répétés.
Cet ELISA à haut débit sensible, spécifique et reproductible est susceptible d'être utile pour détecter les taux d'infection et les changements dans les réponses immunologiques au virus dans les études longitudinales. Il peut également compléter les tests d'ARN viral pour permettre aux chercheurs de détecter les infections récentes et de décrire plus précisément la réponse des anticorps au SRAS-CoV-2. Cela pourrait également aider à dépister les donneurs de plasma et les travailleurs de la santé en convalescence, afin de sélectionner ceux qui risquent le moins de servir les patients COVID-19 de différentes catégories. La durée de l'immunité pourrait également être mieux comprise par des études sérologiques longitudinales sur des individus symptomatiques et asymptomatiques.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
