Une étude de validation de principe est prometteuse pour des techniques de thérapie génique plus sûres pour traiter les immunodéficiences

Dans une étude récente publiée dans Communications naturellesles chercheurs ont décrit une approche pour modifier le gène activant la recombinaison 2 (RAG2) lieu d’applications thérapeutiques.

Le déficit immunitaire combiné sévère (SCID) représente des troubles monogéniques rares avec des défauts de l’immunité humorale et cellulaire. Le CHIFFON les gènes codent pour des protéines qui initient la recombinaison V(D)J spécifique des lymphoïdes, essentielle à la maturation des lymphocytes T et B. Par conséquent, les personnes atteintes de maladies CHIFFON les variantes manquent complètement ou ont beaucoup moins de cellules B et T.

De plus, CHIFFON la transcription des gènes est régulée par des séquences agissant en cis entourant leurs séquences codantes respectives (CDS). CHIFFON les gènes sont exclusivement exprimés au cours du stade G0/G1, avec une expression régulée au cours de phases spécifiques du développement des lymphocytes B et T. La greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) est le seul traitement définitif du SCID.

Néanmoins, les donneurs compatibles avec l’antigène leucocytaire humain (HLA) sont rares et la HSCT haplo-identique, la thérapie alternative, réduit le taux de survie de 60 à 70 %. Une alternative idéale serait ex vivo manipulation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) du patient et transfert ultérieur au patient sous forme de HSCT autologue.

L’étude et les résultats

Dans la présente étude, les chercheurs ont décrit une approche d’édition du génome basée sur de courtes répétitions palindromiques (CRISPR) et de la nucléase 9 associée à CRISPR (Cas9) pour remplacer l’ensemble de la séquence. RAG2 CDS avec un transgène correcteur en cluster de différenciation 34-positif (CD34⁺) HSPC.

Deux vecteurs de virus adéno-associés recombinants de sérotype 6 (rAAV6) ont été synthétisés pour intégrer une cassette d’expression de protéine fluorescente verte (GFP) et une séquence polyA d’hormone de croissance bovine (BGHpA) dans CD34.⁺ HSPC après avoir livré un produit modifié RAG2 ARN guide unique (sgRNA) ou complexe ribonucléoprotéique Cas9.

Le premier donneur a utilisé des bras d’homologie de 400 pb encadrant le site de coupe Cas9 pour l’insertion. En revanche, le deuxième donneur a utilisé un bras d’homologie gauche (LHA) de 400 pb couvrant la séquence en amont du site de coupure et un bras d’homologie droit (RHA) de 400 pb couvrant la séquence en aval du site de coupure. RAG2 codon stop pour remplacer le tout RAG2 CDS avec l’ADN du donneur (désormais CDS-remplacement [CDSR] vecteur).

L’efficacité de la réparation dirigée par homologie (HDR) du premier donneur était supérieure à celle du deuxième donneur. L’efficacité HDR du deuxième donneur était significativement augmentée lorsque la longueur du RHA était augmentée à 800 pb ou 1 600 pb. Ensuite, l’équipe a produit deux vecteurs CDSR supplémentaires ; l’un avait des séquences d’éléments régulateurs post-transcriptionnels (WPRE) de BGHpA et de l’hépatite de la marmotte, et l’autre manquait des deux.

Le vecteur dépourvu des deux éléments induisait un HDR inférieur, tandis que l’efficacité HDR de l’autre était comparable à celle du deuxième donneur étendu. En outre, l’équipe a conçu un donneur de correction CDSR avec un modèle de bras d’homologie de 400 x 800 pb pour le knock-in (KI) du codon divergé optimisé. RAG2 (dcoRAG2) ADN codant (ADNc). La décoRAG2 le codon d’arrêt a été remplacé par une séquence peptidique auto-clivante T2A et un gène rapporteur du récepteur du facteur de croissance nerveuse tronqué (tNGFR).

En outre, deux donneurs de correction CDSR supplémentaires avec des éléments régulateurs synthétiques suivant la séquence tNGFR ont été synthétisés. L’un contenait les séquences WPRE-BGHpA et l’autre la séquence BGHpA. Les donneurs de correction ont montré un HDR efficace spécifique au locus. Les résultats de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont corroboré le HDR très efficace.

L’équipe a effectué un séquençage à répétition terminale inversée (ITR) pour détecter l’intégration des ITR du donneur rAAV6, car les vecteurs donneurs d’AAV peuvent s’intégrer de manière aléatoire dans le génome. Cela a révélé une intégration limitée des ITR, mais pas sur le site cible. Ensuite, l’équipe a conçu les génotypes du CD34 dérivé d’un donneur sain (HD).⁺ HSPC.

L’équipe a obtenu des cellules avec un allèle ciblé par l’un des donneurs de correction et l’autre avec un modèle knock-out (KO). Une méthode en deux étapes a été développée pour enrichir les cellules avec environ 100 % d’allèles modifiés. Ensuite, l’équipe a testé si dcoRAG2 l’expression permettait spécifiquement la différenciation en CD3⁺ Cellules T avec divers répertoires de récepteurs de lymphocytes T (TCR).

En effet, endogène RAG2 l’expression a été éliminée dans les cellules KI-KO, mais dcoRAG2 L’expression de l’ADNc était robuste. De plus, décoRAG2 l’expression du transgène était toujours étroitement régulée et n’était pas surexprimée, facilitant le développement des cellules T par la différenciation des cellules modifiées en CD3⁺ Cellules T au jour 28.

Le CD3⁺ la population a également montré une expression robuste de TCRγδ et CD3⁺ TCRγδ^– les cellules étaient présumées être CD3⁺ TCRαβ⁺. Divers répertoires de recombinaison V(D)J ont été observés dans le RAG2 Cellules KI-KO après dcoRAG2 Expression de l’ADNc au jour 28, sans aucune différence significative dans les clonotypes TCRγ (TRG) ou TCRβ (TRB) entre les populations fictives et KI-KO.

Conclusions

Les chercheurs ont décrit une stratégie qui a complètement remplacé le RAG2 CDS pour traiter les troubles de l’immunité autosomique récessive. La méthode CDSR a induit une dcoRAG2 expression de l’ADNc sans dépasser l’expression endogène RAG2 niveaux d’expression. Les donneurs de correction CDSR ont favorisé la recombinaison et la différenciation réussies de V(D)J en CD3⁺ TCRγδ⁺ et CD3⁺ TCRαβ⁺ Cellules T qui se sont développées en divers répertoires TRG et TRB.

Dans l’ensemble, cette approche peut traiter les mutations tout en conservant les éléments spatio-temporels et régulateurs endogènes et est prometteuse pour une thérapie génique plus sûre.