Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont surveillé les coronavirus (CoV) trouvés chez les chauves-souris via un séquençage génomique ciblé.
Les urgences de santé publique telles que le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) et la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) ont souligné l’importance de surveiller les CoV zoonotiques. De plus, ces urgences ont souligné le manque de connaissances concernant la résolution phylogénétique et plusieurs facteurs génétiques viraux.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont estimé l’efficacité de la capture de la sonde d’hybridation pour enrichir le matériel lié au génome du CoV dans des échantillons oraux et rectaux prélevés sur des chauves-souris.
L’équipe a obtenu des échantillons oraux et rectaux entre août 2015 et juin 2018 de chauves-souris en vente sur les marchés ou capturées puis relâchées dans la nature. Ces échantillons ont été prélevés à différents endroits en République démocratique du Congo (RDC). Les différentes espèces de chauves-souris ont été identifiées par des écologistes via une réaction en chaîne par polymérase (PCR) ciblant le gène du cytochrome B.
Un panel personnalisé ciblant la diversité familière du CoV de chauve-souris a été conçu à l’aide de sondes d’hybridation. La couverture des séquences de référence par les panels personnalisés a été examinée en silicone. La couverture de la sonde a également été évaluée pour un sous-ensemble des séquences de référence représentant des séquences génomiques pleine longueur. L’équipe a utilisé le panel personnalisé pour évaluer la récupération du matériel génomique CoV via la capture de sondes dans 25 bibliothèques de séquences métagénomiques. Ces bibliothèques ont été préparées à partir d’une collection rétrospective de près de 21 écouvillons oraux et rectaux prélevés sur des chauves-souris en RDC de 2015 à 2018.
Le panel de sondes personnalisé a été utilisé pour capturer le matériel génomique CoV à partir de ces bibliothèques métagénomiques d’écouvillons de chauve-souris. Un séquençage génomique a ensuite été réalisé. La récupération du CoV par les sondes a été évaluée en assemblant les lectures de séquençage capturées de novo. Les séquences CoV ont ensuite été déterminées en alignant les contigs sur les séquences de référence CoV. Des mesures de taille d’assemblage ont également été utilisées pour examiner dans quelle mesure les contigs récupérés représentaient des génomes complets.
L’équipe a également estimé la récupération des amplicons partiels d’ARN polymérase (RdRp) dépendants de l’acide ribonucléique (ARN). De plus, leur couverture de sonde en silicone a également été évalué pour démontrer les cibles couvertes par le panel personnalisé. Les chercheurs ont également évalué la concentration et l’intégrité des acides nucléiques, qui étaient deux aspects majeurs corrélés à la préparation réussie de bibliothèques génomiques. Cela a été estimé en tant que valeurs médianes du nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) et concentrations d’ARN. Ces valeurs ont ensuite été comparées à l’étendue des séquences de référence récupérées à partir des bibliothèques correspondantes.
L’influence des angles morts sur la récupération génomique par les sondes du panel a été examinée dans les bibliothèques génomiques. L’équipe a également évalué la couverture de la sonde par rapport aux séquences de référence qui ont été attribuées à un groupe phylogénétique particulier.
Résultats
Les résultats de l’étude ont montré que l’équipe a collecté un total de 4 852 séquences génomiques de CoV de chauve-souris pour concevoir un panel personnalisé comprenant 20 000 séquences de sondes. Dans ce panel, 98,73 % des positions nucléotidiques dans 90 % des séquences cibles étaient suffisamment couvertes. Cela indiquait que le panel personnalisé offrait une large couverture de sonde des CoV de chauve-souris familiers. L’équipe a signalé la récupération de 113 contigs CoV de 17 des 25 bibliothèques de séquençage métagénomique. La taille médiane de l’ensemble contig total était de 1 724 nucléotides, tandis que la taille médiane N50 d’un assemblage était de 533 nucléotides.
Notamment, quatre bibliothèques sur 25 n’ont signalé aucune récupération de séquences CoV, malgré la génération de séquences RdRp partielles à partir de ces bibliothèques. De plus, la capture de la sonde n’a abouti à aucun génome entier de CoV, alors que de nombreux spécimens avaient une couverture dispersée et discontinue des séquences de référence. En outre, 95,3 % des positions des nucléotides dans les amplicons RdRp partiels étaient couvertes par le panel de sondes personnalisées. De plus, pour 12 des 25 bibliothèques séquencées, il n’y a eu aucune récupération d’aucune partie des séquences RdRp partielles séquencées, tandis que sept des 25 bibliothèques avaient plus de 95 % des séquences RdRp partielles entièrement ou presque entièrement récupérées. Cela indiquait que la récupération génomique via la sonde avait des limites autres que l’inclusivité du panel de sondes.
L’équipe a observé de faibles associations monotones de valeurs de RIN et de concentration inférieures avec une récupération génomique plus faible. Cette corrélation était particulièrement significative pour les concentrations d’ARN mais pas pour l’intégrité de l’ARN. Ces relations faibles ont indiqué que des facteurs supplémentaires étaient responsables de la récupération génomique entravée, y compris de faibles concentrations de matériel viral ou un manque de couverture de sonde dans les zones génomiques en dehors de la région de la cible RdRp partielle.
Au total, 92,3 % des séquences de référence, telles que CDAB0203R-PRE, CDAB0217R-PRE et CDAB0492R-PRE, ont été récupérées pour les 25 banques ; cependant, les gènes viraux complets de pointe étaient absents. Cela suggérait la présence de CoV similaires au Bat CoV CMR704-P12 et Chéréphon bat CoV/Kenya/KY22/2006, sauf avec de nouveaux gènes de pointe qui étaient différents des gènes de pointe de la séquence de référence.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré le potentiel de la capture par sonde du matériel génomique du CoV pour évaluer avec précision un plus large éventail de virus.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
