*Avis important: Place de la recherche publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
Les auteurs d’une nouvelle étude en cours d’examen à la revue Rapports scientifiques et actuellement posté sur Place de la recherche preprint* a proposé un nouveau pipeline d’analyse pour aider à identifier les mutations dans les régions d’amorces de réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère (RT-PCR).
À cette fin, ils ont évalué de manière exhaustive la variabilité génétique dans 53 tests de diagnostic du SRAS-CoV-2 accessibles au public en utilisant 16 types différents d’ensembles d’amorces dans leurs régions de liaison à la sonde.
Étude: Identification des mutations dans les régions d’amorce PCR SARS-CoV-2. Crédit d’image : Small365 / Shutterstock
Sommaire
Arrière-plan
Alors que le nombre de mutations dans le génome du SRAS-CoV-2 continue d’augmenter en raison de son évolution continue au cours des deux dernières années de la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), la précision diagnostique du test RT-PCR, considérée comme un test de diagnostic de référence pour le SRAS-CoV-2, a considérablement diminué. Néanmoins, il reste le principal outil de diagnostic pour identifier les personnes infectées par le SRAS-CoV-2 à l’aide d’échantillons d’écouvillons naso- ou oro-pharyngés.
Comme différentes variantes émergent avec de multiples mutations génétiques, cela pourrait réduire l’efficacité d’un ensemble d’amorces RT-PCR spécifique ciblé pour les détecter dans les populations virales du SRAS-CoV-2 réparties dans différentes régions géographiques. En outre, cela peut entraîner des résultats faussement négatifs lors de la détection par RT-PCR. Ainsi, il est crucial de surveiller en continu les variations génétiques (ou mutations) dans les régions d’amorce/sonde RT-PCR à l’aide de séquences génomiques d’isolats de SARS-CoV-2 collectés dans le monde entier.
Les développeurs utilisent généralement un assortiment de systèmes d’amorces dans un seul test RT-PCR, appelé ensemble d’amorces, pour détecter de manière fiable le génome d’un virus (ici SARS-CoV-2) dans un échantillon de test. Cet ensemble est une collection des amorces directes et inverses (et de la sonde) conçues pour amplifier et détecter une seule région cible (TR) dans le génomique viral, bien qu’il puisse également avoir deux ou trois TR dans le génome viral.
Le nombre total de mutations chevauchant la TR, leur localisation génomique au sein de la TR et leur type (mutation ponctuelle, insertion/délétion, transversion ou transition) sont les principaux déterminants de l’efficacité des tests RT-PCR.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont analysé 16 ensembles d’amorces SARS-CoV-2 RT-PCR pour détecter les variations génomiques par rapport à la séquence génomique de référence SARS-CoV-2 originale de Wuhan-Hu1 et trouver des chevauchements dans les TR des 16 RT-PCR ensembles d’amorces.
Ils ont récupéré 987 138 échantillons de la base de données CoVEO collectée entre le 1er janvier et le 31 décembre 2021. Cette base de données compile les données d’échantillons génomiques de bonne qualité de variantes hautement fiables, ce qui a aidé les chercheurs à faire la distinction entre les mutations inoffensives/neutres et éventuellement dommageables. De plus, la base de données CoVEO a fourni une récupération rapide et directe des mutations par rapport aux bases de données contenant uniquement les séquences consensus des échantillons.
Les données de séquençage brutes des échantillons ont également permis le filtrage direct des positions génomiques en fonction de la fréquence allélique alternative et de la profondeur de séquençage. Les chercheurs ont appliqué le même flux de travail de post-traitement sur la base de données de l’Initiative mondiale sur le partage de toutes les données sur la grippe (GISAID) pour vérifier leurs résultats sur un autre ensemble de données. De cette façon, les chercheurs ont compilé une liste complète et brute de mutations chevauchant les TR d’amorces PCR dans les échantillons étudiés, qui pourraient être davantage filtrées lors de l’exploration des effets des mutations encore à émerger sur les performances de la RT-PCR ou de la conception de nouveaux ensembles d’amorces PCR. .
Les chercheurs trouvent des échantillons génomiques viraux sujets à une mauvaise classification à un taux quotidien de près de 2 % ; cependant, le rapport quotidien de ces échantillons susceptibles d’être mal classés dans un ensemble d’amorces donné pourrait atteindre 90 %. Ainsi, l’équipe a calculé le rapport des échantillons avec une, deux, trois variations génomiques ou plus dans les TR d’un système d’amorces donné.
Cela les a aidés à différencier les mutations susceptibles d’endommager l’efficacité de la RT-PCR et celles qui devraient être inoffensives (ou neutres) pour un ensemble d’amorces RT-PCR donné en fonction de l’effet des mutations. De même, les chercheurs ont recherché s’il y avait des échantillons avec des TR endommagés dans plusieurs systèmes d’amorces d’ensembles d’amorces spécifiques.
Pour surveiller si les échantillons présentant des mutations à haut risque dans les TR des différents ensembles d’amorces devenaient plus fréquents, ils ont tracé la proportion d’échantillons ayant un léger risque d’erreur de classification et étant susceptibles d’être mal classés. De plus, l’examen du type et de l’emplacement des variants détectés dans les TR de différents systèmes d’amorces a aidé les chercheurs à les classer comme mutations à risque élevé ou modéré. Enfin, les chercheurs ont analysé la possibilité de prédire que des ensembles d’amorces spécifiques devenaient redondants en raison de mutations émergentes dans le SRAS-CoV-2.
Résultats
L’ensemble d’échantillons génomiques SARS-CoV-2 final de bonne qualité comprenait 665 325 échantillons, dont la plupart appartenaient aux variantes alpha ou delta préoccupantes (VOC). Dans les échantillons de SRAS-CoV-2 étudiés, les chercheurs ont trouvé 1 826 variations génétiques dans 2 188 positions génomiques, chevauchant 141 sites de liaison d’amorces (ou TR).
![Nombre de mutations et leur effet possible sur l'amplification par PCR. un. Le rapport et le nombre d'échantillons avec une (barres vertes), deux (barres jaunes) et trois variantes ou plus (barres rouges) dans les TR de différents systèmes d'amorces. b. Le rapport et le nombre d'échantillons avec des variantes dans les TR de différents systèmes d'amorces. Les échantillons qui contiennent un variant dans au moins une position « à haut risque » dans les TR du système d'amorces donné sont marqués en rouge, d'autres échantillons n'ayant que des mutations « à risque modéré » dans les TR donnés sont présentés en bleu. Pour plus de détails sur la classification des mutations, voir Méthodes. Les noms des systèmes d'amorces sont basés sur la nomenclature : [first author last name]-[target gene name]-[id, when multiple primer systems target the same gene]. Les échantillons sans variantes dans les TR donnés ne sont pas représentés.](https://ma-clinique.fr/wp-content/uploads/2023/03/Une-etude-revele-un-impact-minimal-de-la-variabilite-du.png)
Nombre de mutations et leur effet possible sur l’amplification par PCR. un. Le rapport et le nombre d’échantillons avec une (barres vertes), deux (barres jaunes) et trois variantes ou plus (barres rouges) dans les TR de différents systèmes d’amorces. b. Le rapport et le nombre d’échantillons avec des variantes dans les TR de différents systèmes d’amorces. Les échantillons qui contiennent un variant dans au moins une position « à haut risque » dans les TR du système d’amorces donné sont marqués en rouge, d’autres échantillons n’ayant que des mutations « à risque modéré » dans les TR donnés sont présentés en bleu. Pour plus de détails sur la classification des mutations, voir Méthodes. Les noms des systèmes d’amorces sont basés sur la nomenclature : [first author last name]-[target gene name]-[id, when multiple primer systems target the same gene]. Les échantillons sans variantes dans les TR donnés ne sont pas représentés.
En moyenne, les échantillons de test présentaient 1,16 mutations dans les TR des systèmes d’amorces étudiés. Cependant, la plupart des échantillons n’avaient qu’une seule position de variante sur les TR. Moins d’échantillons dans chaque système d’amorce avaient deux variations ou plus dans les TR, mais ils représentaient moins de 0,5 % de tous les échantillons. Parmi les mutations ponctuelles, 1 677 mutations de transition et 1 510 transversions ont affecté les TR, tandis qu’un nombre beaucoup plus faible de délétions et d’insertions (79 contre 23) ont affecté les TR. Curieusement, différents ensembles d’amorces ciblaient les mêmes sections génomiques dans de nombreux cas.
Étonnamment, la fréquence des échantillons sujets à une mauvaise classification a changé au cours de la période d’étude avec l’avènement des VoC du SRAS-CoV-2 avec des profils mutationnels très divers. Ainsi, il est nécessaire de réévaluer en permanence l’efficacité de la RT-PCR et de mettre à jour les ensembles d’amorces utilisés dans les contextes cliniques et commerciaux, selon les besoins.
Remarquablement, la plupart des échantillons avec n’importe quel nombre de mutations dans les TR d’un système d’amorce donné contenaient principalement des variantes sans effet drastique sur l’efficacité de la RT-PCR en fonction de leur emplacement. De plus, dans la plupart des cas, très peu de TR d’un jeu d’amorces ont été endommagés simultanément dans tous les échantillons de test.
En outre, les résultats de l’étude ont montré que la plupart des échantillons présentant une variation des TR d’une région de liaison de sonde avaient généralement une mutation ponctuelle unique, ce qui, dans la plupart des cas, était peu susceptible d’influencer la sensibilité du processus de RT-PCR. Cependant, les chercheurs ont trouvé les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) les plus fréquents chevauchant tous les TR dans plus de 50% des échantillons, principalement du Delta VOC. En outre, ce SNP s’est avéré être à haut risque dans deux amorces sens.
Pendant la prédominance de l’Alpha VOC, la mutation par délétion His69_Val70del chevauchait l’amorce sens TR de Young-S, détectée dans un nombre relativement élevé d’échantillons. Les souches Omicron, BA.1 et BA.3, présentaient également cette mutation par délétion, ce qui aurait pu réduire l’efficacité de la RT-PCR de deux ensembles d’amorces appartenant au kit TaqPath et Young-set. Bien que les variations génomiques dans les TR des 16 ensembles d’amorces étudiés aient été principalement faibles et que le ratio d’échantillons affectés soit resté inférieur à 1 %, un pipeline facile à déployer pour étudier la fréquence des mutations dans les TR est indispensable.
Étant donné que les ensembles d’amorces fonctionnent différemment d’un groupe de variants à l’autre, il est important de surveiller en permanence le ratio d’échantillons sujets à une mauvaise classification pour déterminer si l’ensemble d’amorces donné convient à la détection d’échantillons de SARS-CoV-2 de la lignée qui se propage actuellement.
conclusion
L’étude actuelle a souligné la nécessité d’une surveillance continue des mutations dans le génome du SRAS-CoV-2 qui pourraient réduire ou entraver l’efficacité des ensembles d’amorces utilisés dans les tests de diagnostic RT-PCR actuels. Bien que les chercheurs aient observé que les TR de bon nombre des amorces étudiées étaient sujettes à des mutations dans les échantillons analysés, des investigations supplémentaires sont justifiées pour déterminer si ces variations avaient le potentiel de réduire la sensibilité de la PCR dans un cadre clinique.
Un seul test RT-PCR utilise plusieurs systèmes d’amorces pour cibler simultanément plus d’une région génomique dans un génome viral. Cependant, dans un ensemble d’amorces, plusieurs systèmes d’amorces pourraient avoir un TR endommagé dans le génome séquencé de tous les échantillons étudiés. Ainsi, un seul test RT-PCR ayant un TR endommagé dans plus de 50 % des systèmes d’amorces employés pourrait donner un résultat de test positif.
Pour résumer, sur la base des preuves antérieures et des données bioinformatiques de cette étude, les variations génétiques connues dans la population du SRAS-CoV-2 ont eu un impact minime ou nul sur la sensibilité des tests de diagnostic RT-PCR. De plus, comme la plupart des variants observés étaient neutres, ils ne pouvaient pas potentiellement perturber le processus de RT-PCR. Cependant, les chercheurs ont noté trois exceptions : une mutation couvrant les nucléotides G28881A, G28882A et G28883C, un SNP dans une amorce TR près de l’extrémité 3′ de G15451A et une délétion dans la séquence ATCATG21764A, qui se sont toutes produites à un taux élevé dans le test. échantillons.
Néanmoins, les résultats de l’étude ont confirmé que le test RT-PCR basé sur l’un des 16 ensembles d’amorces étudiés dans cette étude pouvait détecter de manière plus fiable les COV alpha et delta du SRAS-CoV-2.
*Avis important: Place de la recherche publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
