Dans une étude récente publiée dans eLifeun groupe de chercheurs a étudié le rôle des cylicines dans la spermiogenèse et la fertilité masculine chez les souris et les humains grâce à l’édition de gènes de courtes répétitions palindromiques regroupées régulièrement espacées (CRISPR)/protéine 9 associée à CRISPR (Cas9).
Arrière-plan
La spermiogenèse, transformant les spermatides rondes en spermatozoïdes, implique des processus complexes tels que la condensation de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et le développement de l’acrosome et du flagelle, largement dépendants d’un cytosquelette spécialisé dans les spermatozoïdes. La thèque périnucléaire (PT), un composant essentiel de ce cytosquelette, est composée de plusieurs protéines, dont la Cylicine 1 (Cylc1) et la Cylicine 2 (Cylc2).
Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pleinement les rôles complexes des cylicines dans la spermiogenèse, compte tenu de leur implication essentielle dans l’architecture de la tête des spermatozoïdes et de la fertilité masculine, ainsi que de leur structure protéique unique et de leur conservation évolutive d’une espèce à l’autre.
À propos de l’étude
Conformément aux lois allemandes sur la protection des animaux et aux directives institutionnelles, des expériences sur des souris déficientes en Cylc1 et Cylc2 ont été menées après avoir reçu les approbations nécessaires. Ces souris génétiquement modifiées ont été créées grâce à la technologie CRISPR/Cas9 sur des zygotes B6D2F1. Deux méthodes distinctes ont été utilisées : la microinjection d’acides ribonucléiques à guide unique (sgRNA) et d’ARN messager Cas9 (ARNm) pour Cylc1, et l’électroporation de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) pour Cylc2. Les génotypes de la progéniture ont été déterminés et les allèles génétiquement modifiés ont été isolés par rétrocroisement avec des souris C57Bl/6J. Ces lignées ont ensuite été enregistrées et conservées pour des études ultérieures.
L’extraction de l’ADN génomique a suivi la méthode HotShot et des réactions en chaîne par polymérase (PCR) ont été réalisées pour le génotypage. Les mâles de ces lignées ont subi des analyses de fertilité, notamment l’accouplement avec des femelles C57Bl/6J et la surveillance de la grossesse et de la taille des portées. Des échantillons de sperme ont été collectés pour diverses analyses, notamment des évaluations de la concentration, de la viabilité, de la motilité et de la morphologie, selon des protocoles établis. L’ARN du tissu testiculaire a été extrait pour une PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR), en se concentrant sur l’expression de Cylc1 et Cylc2.
Des fractions de protéines subcellulaires provenant de spermatozoïdes ont été isolées pour une analyse par Western blot. Des études protéomiques ont été menées à l’aide de l’approche SP3, suivies d’une analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) des peptides. La microscopie à haute résolution et la microscopie électronique à transmission (TEM) ont fourni des informations détaillées sur la structure et la morphologie des spermatozoïdes.
Les taux d’évolution des gènes Cylicin ont été analysés pour comprendre leur conservation et leur variation entre les espèces de mammifères. L’étude a également inclus une cohorte de plus de 2 030 hommes souffrant de problèmes de reproduction, où un séquençage complet de l’exome a été effectué pour identifier des variantes génétiques rares dans CYLC1 et CYLC2. Les données de ces patients ont été rigoureusement analysées, conformément aux directives de l’American College of Medical Genetics and Genomics – Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP), afin de discerner tout lien potentiel avec l’infertilité.
Le séquençage de Sanger a validé les variantes identifiées et des échantillons de sperme humain ont été examinés conformément aux directives de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) et à la coloration par immunofluorescence. Des analyses statistiques de toutes les expériences ont été effectuées, garantissant une interprétation et une validation rigoureuses des données.
Résultats de l’étude
La recherche sur les cylicines a révélé plusieurs découvertes importantes concernant leur rôle dans la spermatogenèse et la fertilité chez la souris et chez l’homme. Il a été observé qu’un déficit en cylicine provoquait un détachement de l’acrosome de l’enveloppe nucléaire (NE) pendant la phase de couverture de la biogenèse de l’acrosome. Cet effet reflète le relâchement de l’acroplaxome de la membrane nucléaire externe observé dans la perte de CCIN, une autre protéine cruciale pour le complexe membrane acrosomale (IAM)-PT-enveloppe nucléaire (NE). On suppose que les cylicines, éventuellement en conjonction avec le CCIN, forment une « colle moléculaire » nécessaire à l’ancrage acrosomique.
De plus, le déficit en cylicine chez la souris a entraîné d’autres défauts morphologiques notables dans les spermatozoïdes matures, notamment un allongement excessif de la manchette, son démontage retardé et la formation de lacunes inhabituelles dans le PT au niveau de l’anneau périnucléaire. On pense que ces défauts proviennent de dysfonctionnements du transport intra-manchette (IMT), un processus crucial pour le transport des protéines lors de la spermiogenèse. Les résultats indiquent que les cylicines pourraient jouer un rôle dans le maintien de l’intégrité et du contact entre les régions PT caudale et apicale.
L’analyse évolutive des gènes Cylc1 et Cylc2 chez les primates et les rongeurs a montré que les deux sont sous sélection purificatrice, Cylc1 étant sous une contrainte légèrement moins contrôlée que Cylc2. Cette observation a conduit à l’hypothèse que la perte de Cylc1 pourrait être moins sévère et pourrait être compensée par Cylc2 en raison d’une redondance partielle. Chez les souris mâles, le déficit en Cylc1 a entraîné une hypofertilité, alors que la perte des deux allèles Cylc2 a conduit à l’infertilité, ce qui conforte cette hypothèse. De plus, Cylc2+/- les mâles ont conservé leur fertilité, ce qui suggère qu’un seul allèle fonctionnel Cylc2 pourrait compenser la perte de Cylc1, bien qu’au moins deux allèles fonctionnels soient nécessaires pour une fertilité masculine complète.
L’étude a également noté que le taux d’évolution de la région C-terminale riche en lysine des Cylicines est très variable, fluctuant entre les sites de codons conservés et sélectionnés positivement. Les résidus lysine eux-mêmes sont fortement conservés, ce qui indique que des modifications dans la région C-terminale pourraient conférer un avantage adaptatif.
Dans les cas humains, les défauts morphologiques des spermatozoïdes et l’infertilité observés chez un patient présentant des variantes des deux gènes Cylicin corroborent les résultats obtenus chez la souris. L’absence de CYLC1 et la localisation altérée du CCIN dans le sperme du patient suggèrent que les protéines PT jouent des rôles similaires chez l’homme et les rongeurs. Cependant, l’étude reconnaît la possibilité de divergences entre les espèces et la nécessité de recherches plus approfondies pour confirmer les implications de ces variantes dans l’infertilité humaine.
Enfin, l’étude mentionne un cas où le père d’une patiente a hérité de la variante faux-sens CYLC2 mais n’a pas connu d’infertilité complète, bien qu’il ait signalé des difficultés de conception naturelle. Cette observation suggère un effet potentiel des variants pathogènes hétérozygotes CYLC2 sur la fertilité. La recherche souligne la nécessité d’une identification et d’une caractérisation plus approfondies des patients présentant des variantes CYLC1 et CYLC2 afin de tirer des conclusions plus définitives sur leur impact sur la spermiogenèse et l’infertilité.
