En capturant les deux ensembles de chromosomes hérités et en atteignant les régions génomiques manquées par les références conventionnelles, T2T-HG002 pourrait aider à faire évoluer la génomique d’un appel de variantes basé sur une référence vers des génomes personnalisés complets.
Étude : Une référence complète du génome humain diploïde pour la génomique personnalisée
Dans une étude récente publiée dans la revue Celluleles chercheurs ont développé une référence complète et presque parfaite du génome humain diploïde pour la génomique personnalisée. Incluant des séquences de chromosomes autosomiques et sexuels, ce cadre d’analyse comparative du génome aborde les limites de l’analyse comparative conventionnelle des variantes basée sur des références.
Alors que les approches conventionnelles s’appuient généralement sur une séquence génomique existante pour l’identification des variantes, cette nouvelle stratégie fournit une approche télomère à télomère (T2T) référence qui permet de distinguer les erreurs de séquençage et d’assemblage de la véritable variation génétique tout en évitant les biais causés par des erreurs, des lacunes et des différences structurelles dans les génomes de référence externes. Cette avancée pourrait aider les chercheurs à analyser des régions génomiques auparavant inaccessibles et, à terme, soutenir une interprétation plus complète de la variation génétique associée à la maladie.
Les approches conventionnelles de reséquençage ont souvent du mal à détecter les changements structurels et les régions très variables du génome liées aux maladies génétiques humaines. Le séquençage à lecture courte a souvent du mal à distinguer des régions dupliquées très similaires ou à attribuer des variantes génétiques à leurs copies parentales respectives, tandis que les différences structurelles entre les génomes peuvent affecter davantage la précision. Des stratégies améliorées sont nécessaires pour améliorer la précision du séquençage du génome et accélérer la médecine génomique personnalisée.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé une référence génomique T2T presque parfaite et presque complète pour évaluer le génome diploïde humain largement utilisé HG002 dans le cadre du projet Q100. La plupart des données de séquençage provenaient de cellules lymphoblastoïdes HG002 en culture. Contrairement aux références de variantes traditionnelles qui comparent les variantes à un génome de référence, cette approche repose sur une séquence génomique diploïde presque complète et très précise comme norme de référence, séparant les erreurs de séquençage et d’assemblage des véritables différences génétiques entre l’échantillon et un génome de référence externe. Cette approche d’analyse comparative du génome évite les biais de référence et évalue directement l’inférence du génome et la précision des haplotypes.
Les chercheurs ont cartographié les gènes et l’acide désoxyribonucléique répétitif (ADN) régions dans les deux copies parentales de l’assemblage T2T-HG002, permettant une comparaison directe entre les haplotypes maternels et paternels. Ils ont également établi des approches pour évaluer l’exactitude du séquençage, déterminer les différences génétiques résolues par les allèles et comparer les assemblages du génome à la séquence de référence diploïde. Cela a permis d’évaluer la précision de base, la résolution des haplotypes et les changements génomiques à grande échelle tout en répondant aux limites des méthodes d’analyse comparative des variantes antérieures.
Le génome HG002 a été assemblé à l’aide de données de séquençage à lecture longue de PacBio HiFi et Oxford Nanopore Technologies (ONTARIO), complété par le séquençage parental Illumina pour la mise en phase et les données Strand-seq et Hi-C pour l’échafaudage. Fluorescence sur place hybridation (POISSON) ADN ribosomal validé (ADNr) échafaudage et a aidé à estimer la taille des matrices d’ADNr.
L’équipe a amélioré l’assemblage T2T-HG002 grâce à des séries successives de correction d’erreurs et de validation par rapport à des ensembles de données de séquençage indépendants. La version v1.1 résultante contenait 38 037 petits correctifs et 14,18 millions de paires de bases de régions de consensus corrigées. La précision et le déroulement de l’assemblage ont été évalués à l’aide de Merqury, tandis que les locus d’immunoglobulines ont été validés manuellement. Les chercheurs ont également développé GQC logiciel pour évaluer les assemblages par rapport à la référence et comparer plusieurs assemblages HG002 générés à l’aide de différentes technologies de séquençage sur cinq ans.
Résultats
Le benchmark était exempt d’erreurs détectables sur 99,4 % du génome diploïde. Il incorporait 701,4 Mo supplémentaires (11,7 %) d’ADN autosomique de haute confiance et 216,8 Mo de séquences de chromosomes sexuels manquantes dans la référence précédente v4.2.1. Contrairement aux séquences de référence humaines conventionnelles, qui représentent généralement un seul haplotype, T2T-HG002 contient à la fois des haplotypes maternels et paternels, fournissant une représentation diploïde à deux haplotypes. L’outil GQC analyse ces assemblages génomiques en distinguant les deux copies parentales, permettant ainsi une évaluation plus précise des régions génomiques complexes.
Les progrès dans le séquençage T2T et la reconstruction du génome ont amélioré la caractérisation des régions génomiques qui étaient auparavant difficiles à résoudre, notamment les séquences dupliquées, les groupes de gènes élargis, les régions d’ADN satellite et les structures d’ADN répétitives. Une comparaison à l’échelle du génome a révélé que de novo les assemblages de génomes ont récupéré deux à sept pour cent de séquences en plus que les génomes reconstruits à partir d’appels de variantes et ont atteint une précision environ dix fois supérieure à l’échelle du génome.
Après affinement, le score de qualité de l’assemblage est passé de Q63.1 dans la version 0.7 à Q68.9 dans la version 1.1. Dans environ 2,66 Go couverts de manière fiable par les deux benchmarks, des écarts avec le précédent Genome in a Bottle (GIAB) le benchmark est passé de 5 972 à 219 variantes, les auteurs attribuant presque toutes les différences restantes aux erreurs de l’ancien benchmark.
L’annotation HG002 a identifié 13 gènes autosomiques uniquement maternels et 12 gènes uniquement paternels, y compris des gènes à nombre de copies variables tels que la phosphatase à double spécificité 22 (DUSP22), complément au facteur H lié 1 (FCHR1), complément au facteur H lié 3 (FCHR3), glutathion S-transférase thêta 1 (GSTT1), et la glutathion S-transférase mu 1 (GSTM1). Les chercheurs ont également intégré des ensembles de données génomiques fonctionnelles à lecture longue, notamment des profils de méthylation, d’accessibilité de la chromatine et de transcriptome, offrant ainsi une couverture à l’échelle du génome des deux haplotypes.
L’analyse comparative des assemblages HG002 précédents a montré des améliorations progressives en termes d’exhaustivité et des réductions des erreurs de substitution, d’indel et de commutation de phase, le T2T-HG002 fournissant la vérité terrain à des fins de comparaison. Les génomes construits par des variantes représentaient une fraction plus petite du génome de HG002 que de novo assemblées, démontrant que l’analyse comparative du génome complet peut réduire les biais de référence dans l’évaluation et révéler des opportunités d’améliorer la reconstruction personnalisée du génome.
Conclusion
L’étude présente une référence du génome diploïde humain HG002 télomère à télomère qui est exempte d’erreurs détectables sur 99,4 % du génome, offrant une plus grande exhaustivité et une plus grande précision que les références précédentes. Bien que les 46 chromosomes atteignent la continuité T2T, l’intérieur de certaines matrices d’ADNr reste inachevé. En tant qu’Institut national des normes et de la technologie (NIST) matériel de référence avec des références de variantes établies, HG002 offre une ressource idéale pour développer des approches génomiques personnalisées basées sur des génomes diploïdes complets. Le benchmark permet d’évaluer les assemblages de génomes, les appels de variantes par étapes, les lectures de séquençage et les haplotypes au niveau du pangénome dans les technologies actuelles et émergentes.
Dans les études futures, les chercheurs devraient établir des mesures standardisées d’analyse comparative du génome et identifier les sites variantes cliniquement pertinents dans les génomes diploïdes sans biais de référence. L’appel de variantes reste la principale approche en génomique clinique, et les méthodes permettant de traduire les performances d’analyse comparative du génome entier en interprétation clinique ne sont pas encore standardisées. Les progrès du séquençage pourraient aider à résoudre des régions complexes telles que les matrices d’ADNr, tandis que l’application du GQC sur divers génomes pourrait permettre une analyse plus complète du génome entier. Les auteurs notent également que les cellules HG002 contiennent de faibles niveaux de variation somatique et que certaines régions génomiques répétitives restent difficiles à valider.
