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Des chercheurs de l'Institut Paul Scherrer en Suisse ont développé une protéine virale recombinante de haute qualité qui pourrait être appliquée au développement de vaccins contre le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) et à la détection de nouveaux virus ou anticorps.
L'équipe a développé un domaine de liaison au récepteur de pointe (RBD) 2019-nCoV soluble qui est marqué avec une protéine fluorescente pour permettre une détection facile.
Le pic RBD est le sous-domaine trouvé sur 2019-nCoV qui se lie à l'enzyme 2 de conversion de l'angiotensine (ACE2) du récepteur de la cellule hôte humaine pour entrer dans le virus.
Le pic RBD est, par conséquent, une cible clé dans la recherche de découverte de médicaments et le développement de vaccins.
Roger Benoit et ses collègues disent que la protéine de fusion qu'ils ont développée est de haute pureté protéique, soluble et capable de former un complexe avec le domaine peptidase de l'ACE2 humaine.
En outre, le protocole d'expression et de purification des protéines utilisé par les chercheurs ne nécessite que des techniques et du matériel de culture cellulaire standard.
Une version pré-imprimée du papier est disponible sur le serveur bioRxiv *, tandis que l'article fait l'objet d'un examen par les pairs.
Vue d'ensemble schématique des principales caractéristiques de la région d'expression de la construction (pas à l'échelle). Promoteur CMV (PCMV), opérateurs de tétracycline (2X TetO2), séquence consensus de Kozak (Kozak), interféron alpha 2 humain (IFNα2) peptide signal comprenant le codon de départ pour la protéine de fusion complète, la protéine fluorescente jaune (YFP), le site de clivage de la protéase 3C du rhinovirus humain (HRV 3C), le pic 2019-nCoV RBD (S RBD), 8xHis-tag (His-tag), deux codons stop (Stop), séquence de polyadénylation BGH (BGA pA). Des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction uniques importants sont indiqués.
Cibles importantes dans les études de découverte de médicaments et de développement de vaccins
Le 2019-nCoV est l'agent causal de la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) qui continue de balayer le monde, posant une menace majeure pour la santé publique.
Un domaine d'intérêt crucial pour les scientifiques est le développement de protéines virales recombinantes de haute qualité qui faciliteraient la recherche liée au développement de vaccins et à des tests de détection améliorés, ainsi qu'une compréhension globale du virus.
Étant donné que le RBD de 2019-nCoV lie l'ACE2 humain avec une haute affinité, il est devenu une cible importante dans la recherche sur la découverte de médicaments et le développement de vaccins.
Sommaire
Qu'ont fait les chercheurs?
Benoit et ses collègues ont entrepris de produire un RBD de pointe 2019-nCoV soluble de haute qualité, marqué par fluorescence pour améliorer la détection.
Maintenant, les chercheurs ont décrit une construction et un protocole pour l'expression et la purification de quantités en milligrammes de RBD de pointe 2019-nCoV marquée par la protéine fluorescente jaune N-terminale (YFP).
La protéine de fusion comprend un peptide signal d'interféron alpha 2 (IFNa2) N-terminal, un YFP amélioré, un marqueur FLAG, un site de clivage de la protéase 3C du rhinovirus humain, le RBD de la protéine de pointe 2019-nCoV et un 8x C-terminal Son étiquette.
Étant donné que le pic RBD 2019-nCoV contient des liaisons disulfure et des glycosylations N-liées, il est généralement produit par sécrétion à partir de cellules eucaryotes.
L'équipe rapporte que l'expression de la protéine de fusion est réalisée par sécrétion dans un milieu sans sérum à partir de cellules de rein embryonnaire humain 293 adhérentes transfectées de manière stable.
«Le protocole n'implique que des techniques et des équipements de culture cellulaire standard», écrit l'équipe.
Une pureté élevée des protéines a été obtenue
L'analyse par électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) a montré que le procédé de purification par chromatographie d'affinité aux ions métalliques immobilisés (IMAC) Ni-NTA que l'équipe a utilisé a donné une très grande pureté des protéines.
La purification IMAC initiale à petite échelle à partir de 200 ul de résine Ni-NTA a donné 280 ug de protéines de haute pureté.
L'analyse par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) et microscopie électronique à coloration négative a montré que la protéine de fusion était soluble et monodispersée.
Lors de l'incubation de la protéine de fusion purifiée avec l'enzyme Peptide: N-glycosidase F (PNGase F), l'équipe a constaté que la migration sur SDS-PAGE était légèrement plus rapide, indiquant la présence de glycosylations N-liées dans la protéine sécrétée.
L'analyse par spectrométrie de masse a confirmé la présence de ces glycosylations et leur réduction après traitement à la PNGase.
La protéine de fusion a formé un complexe avec l'ACE2 humaine
Pour tester si la protéine de fusion marquée par YFP se lie à l'ACE2 humaine cible, l'équipe a produit un domaine de peptidase ACE2 humaine purifiée et a analysé les deux protéines par SEC. L'analyse a confirmé que la protéine de fusion se lie au domaine peptidase ACE2 humaine, à la fois lorsqu'elle est fusionnée avec YFP et après élimination de YFP par clivage protéolytique.
Les résultats ont conduit l'équipe à proposer des domaines de recherche potentiels dans lesquels la protéine de fusion pourrait être appliquée.
«Les applications possibles de la protéine de fusion comprennent les études de liaison sur les cellules ou in vitro, le marquage fluorescent de sites potentiels de liaison au virus sur les cellules, l’utilisation comme antigène pour les études d’immunisation ou comme outil pour le développement de nouveaux virus ou anticorps tests », concluent Benoit et ses collègues.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
