Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont introduit un test de dépistage phénotypique pour identifier les composés présentant un potentiel d’inhibition du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) basé sur l’activation de la caspase 3/7.
Plusieurs types de tests ont été développés pour la détection des variants du SARS-CoV-2, y compris les tests basés sur les anticorps pour la détection de l’antigène du SARS-CoV-2 et les tests génétiquement modifiés ; cependant, les tests présentent plusieurs inconvénients, tels que des exigences de manipulation manuelle ou une plage de détection étroite. Par conséquent, des tests de culture cellulaire robustes et larges mais simples à réaliser sont nécessaires pour identifier les médicaments anti-SARS-CoV-2.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un test de dépistage phénotypique SARS-CoV-2 à haut débit pour identifier les composés anti-SARS-CoV-2 basés sur l’activation de la caspase 3/7.
La lignée cellulaire d’adénocarcinome du côlon humain (Caco-2) Caco-2-F03 a été utilisée pour les expériences de culture cellulaire. De plus, les cellules Caco-2 ont été obtenues à partir de plusieurs sources et désignées comme Caco-2A, -2B et -2C pour discriminer la lignée cellulaire Caco-2 originale des auteurs (Caco-2-F03) des autres. L’équipe a comparé Caco-2F03 à d’autres modèles de culture cellulaire qui pourraient être utilisés pour identifier des médicaments anti-SARS-CoV-2 potentiels.
La sensibilité des cellules Calu-3 (lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain), Caco-2-F03, A549-ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine 2) et Vero aux souches SARS-CoV-2 telles que G614, D614, Alpha, Beta, et Delta ont été comparés et confirmés par immunocoloration S. En outre, l’activité de la caspase dans la lignée cellulaire Caco-2-F03 infectée par différents isolats du SRAS-CoV-2 a été évaluée 24 et 48 heures après l’infection (hpi).
La bibliothèque d’inhibiteurs de kinase comprenant 1796 inhibiteurs de kinase a été criblée pour les composés médicamenteux qui ont diminué l’activation de la caspase induite par le SRAS-CoV-2 de> 90%, y compris des médicaments connus et potentiels tels que la protéine kinase à double spécificité (CLK-1), la phosphoglycérate déshydrogénase (PHGDH ) et les inhibiteurs des récepteurs du facteur 1 stimulant les colonies (CSFR). Le remdesivir (10 µM) a été utilisé comme contrôle positif. L’équipe a également étudié si la thérapie combinée de NCT-503 et de 2DG pouvait encore améliorer les effets anti-SARS-CoV-2 par rapport à une thérapie médicamenteuse unique.
L’activité de la caspase 3/7 et la coloration du SARS-CoV-2 S par différents candidats-médicaments ont été comparées à celles de médicaments ayant une efficacité anti-SARS-CoV-2 connue tels que le remdesivir, l’EIDD-1931, la ribavirine, le nirmatrelvir et le nafamostat en utilisant G614- cellules Caco-2-F03 infectées. La validité des résultats du test de la caspase 3/7 a été confirmée en comparant les titres de protéines de la nucléocapside (N) anti-SARS-CoV-2 et l’analyse Western Blot.
Les cultures d’interface air-liquide (ALI) de cellules épithéliales bronchiques (HBE) ont été examinées pour la perturbation cellulaire pendant l’infection par le SRAS-CoV-2 par résistance électrique transépithéliale (TEER) et la cytotoxicité du SRAS-CoV-2 a été évaluée sur la base de la déshydrogénase lactique (LDH) Libération. Les niveaux d’ARN génomique du SRAS-CoV-2 ont été évalués en fonction du nombre de copies détectées par réaction en chaîne par polymérase (PCR).
Résultats
Caco-2-F03 a démontré les meilleures performances car il contenait un phénotype stable sensible au SRAS-CoV-2 [indicated by high SARS-CoV-2 S levels and cytopathic effect (CPE) formation] et n’a pas produit de résultats faussement positifs dus à la phospholipidose induite par les médicaments. Les cellules Caco-2-F03 sont restées SARS-CoV-2-permissives pendant 30 passages avec des niveaux élevés de SARS-CoV cellulaire, de récepteur SARS-CoV-2 ACE2 et de sérine protéase transmembranaire 2 (TMPRSS2).
La caspase-3/7 a montré une activité six fois à huit fois plus élevée que les caspase-8 et 9, indiquant une plus grande robustesse. Par conséquent, la détection de la caspase 3/7 a été choisie pour le dépistage. L’infection des cellules Caco-2-F03 avec différents isolats de SARS-CoV-2 a effectivement activé la caspase 3/7, reflétée par les niveaux de SARS-CoV-2 S et d’ARN. L’activité de la caspase 3/7 a permis de surveiller la réplication du SRAS-CoV-2 dans les lignées cellulaires telles que les cellules Vero et la réplication des coronavirus humains (hCoV) tels que le syndrome respiratoire du Moyen-Orient CoV (MERS-CoV), HCoV-229E et SARS-CoV dans les cellules CaCo-2-F03.
En outre, l’activation de la caspase 3/7 induite par le SRAS-CoV-2 et le CPE ont été observés dans les cardiomyocytes pluripotents humains (CMS) et les hépatocytes. La caspase 3/7 a permis l’évaluation des titres d’anticorps neutralisants (nAb) dans les sérums de sept donneurs obtenus 14 jours après la deuxième vaccination par l’ARN messager (ARNm)-1273. Une plus grande neutralisation du G614 a été observée que la neutralisation Alpha et Gamma et la souche résistante au remdesivir a démontré une sensibilité accrue à la ribavirine et à l’EIDD-1931. La substitution de Gly671Ser dans l’ARN polymérase a probablement induit la résistance au remdesivir.
Lors du criblage, 81 composés ayant une activité anti-SARS-CoV-2 ont été identifiés avec le plus de résultats par CaMK (calmodulin-dependent protein kinase), mTOR (mammalian target of rapamycin), ULK (unc-51 like autophagy activating kinase 1) , CLK-1, TOPK (protéine kinase d’origine cellulaire T-LAK), CSF-1R et PAK (kinases activées par p21). NCT-503 (inhibiteur de PHGDH) a inhibé l’activation de la caspase 3/7 induite par Delta et Omicron et a également inhibé la réplication du SRAS-CoV-2 dans les cultures ALI et l’activité de NCT-503 a augmenté en se combinant avec le 2-désoxy-D-glucose (2DG, un inhibiteur de l’hexokinase 2).
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que l’activation de la caspase 3/7 par différentes variantes du SRAS-CoV-2 (y compris les souches résistantes au remdesivir et d’autres hCoV) pourrait être utilisée comme une simple plate-forme de dépistage phénotypique à haut débit pour identifier les anti-SRAS-CoV- 2 candidats-médicaments avec une large gamme de modèles de culture cellulaire, indépendamment du CPE.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
