Le virus monkeypox (MPXV), qui a été isolé pour la première fois en 1958, est un virus à ADN double brin (dsDNA). Il a été reconnu comme une maladie zoonotique lorsque le premier cas humain a été détecté en République démocratique du Congo en 1970. Le MPXV suscite actuellement une inquiétude mondiale en raison de sa transmission plus large depuis l’Afrique centrale et occidentale.
Une détection rapide, ultrasensible et spécifique est essentielle pour freiner la propagation de ce virus. Dans une nouvelle étude publiée sur medRxiv* serveur de préimpression, des chercheurs en Chine ont développé un test MPXV combinant pour la première fois des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster et une protéine associée à CRISPR (CRISPR / Cas) et une amplification assistée par recombinase (RAA). Le test a montré une sélectivité élevée et a pu faire la distinction entre MPXV et d’autres orthopoxvirus.
Étude : Test viral ultrasensible et sur site du monkeypox médié par CRISPR/Cas12a. Crédit d’image : Yeti pointillé / Shutterstock
Sommaire
Arrière plan
Actuellement, le test MPXV utilise des méthodes telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA), la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP). La PCR est l’étalon-or et est précise et sensible mais difficile à déployer dans les zones à faibles ressources. ELISA pourrait fournir des résultats faussement positifs pour une vaccination récente ou à distance, et les inconvénients de LAMP sont liés à une conception d’amorce compliquée, à de mauvaises performances quantitatives, etc. Les méthodes rapides, ultrasensibles et peu coûteuses facilitant la détection MPXV sur site et facile sont restées absentes.
À propos de l’étude
CRISPR/Cas a été découvert pour la première fois dans le système immunitaire adaptatif des procaryotes. Le système CRISPR/Cas12a intègre la transduction du signal et la bioreconnaissance a été utilisée pour détecter plusieurs virus, dont le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). Il présente de nombreux avantages liés aux conditions douces, à la haute sensibilité, à la facilité d’utilisation et à la puissante amplification du signal.
À ce jour, les problèmes critiques liés à l’utilisation de la technologie CRISPR dans la détection du MPXV, tels que le dépistage des sondes, les performances analytiques, la préamplification et les tests au point de service (POCT), n’ont pas été signalés. Par conséquent, la présente étude a proposé pour la première fois un test rapide et ultrasensible combinant l’amplification assistée par recombinase (RAA) et CRISPR/Cas12a, c’est-à-dire le test RAA-Cas12a-MPXV. Le principe comprenait trois étapes : amplification RAA, clivage CRISPR/Cas12a et sortie du signal.
Principaux résultats
Dans la première étape, RAA sélectionnant la matrice d’ADN a produit un grand nombre d’amplicons. Cela a augmenté la sensibilité du test de manière significative. Dans la deuxième étape, l’activité de trans-clivage de Cas12a a été activée, ce qui a entraîné le clivage de nombreux reporters d’ADNsb. La dernière étape a produit deux modes de sortie de signal différents : un test de fluorescence pour les reporters FQ et une bande de flux latéral, ce qui a amélioré la convivialité et l’adéquation du test RAA-Cas12a-MPXV.
Les résultats de fluorescence avec ou sans matrices d’ADN et le produit RAA ont été comparés pour évaluer la faisabilité du test. Le groupe sans ADN était le témoin, qui n’a montré aucun changement de fluorescence significatif. Cela indique qu’en l’absence de matrices d’ADN, aucun amplicon RAA n’a été généré pour qu’il soit reconnu par CRISPR/Cas12a ultérieur.
Pour assurer une plus grande sélectivité et sensibilité, trois paires d’amorces qui se lient à divers sites du gène F3L spécifique du MPXV ont été conçues. Pour cribler les amorces optimales pour les expériences futures, le test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV et l’électrophorèse sur gel d’agarose (AGE) ont été effectués. La troisième paire (F2+R2) a obtenu la bande d’amplification spécifique la plus brillante.
De nombreuses conditions expérimentales importantes liées au système CRISPR/Cas12a et au test RAA-Cas12a-MPXV ont été optimisées, la température et le temps de réaction de RAA étant les premiers. Ensuite, le système CRISPR/Cas12a avec crRNA2 a été optimisé.
Le test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV a été jugé facile à utiliser et susceptible d’être utilisé pour des tests rapides. Comparé au test de fluorescence PCR-Cas12a-MPXV, le test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV a révélé une sensibilité exceptionnelle avec une limite de détection (LOD) 1000 fois inférieure.
La sélectivité du test de fluorescence RAA-Cas12a-MPXV a été déterminée en comparant le degré de fluorescence produit par MPXV avec d’autres virus, tels que le virus de la variole (VARV), le virus cowpox (CPXV), le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus-2 (SARS- CoV-2), le virus Toxoplasma Gondii (TOXV) et le virus de la peste porcine africaine (ASFV). L’observation à l’œil nu et les valeurs de fluorescence ont indiqué que seul le MPXV induisait une fluorescence accrue, contrairement aux autres virus.
Le FAM-Biotine journaliste (Facebook–journaliste) a été conçu pour remplacer le rapporteur FQ du test de fluorescence, et par la suite, le test de bandelette à flux latéral RAA-Cas12a-MPXV a été établi pour POCT. L’ajout d’une solution de réaction contenant des rapporteurs FB intacts fissurés des FAM et de la biotine dans les tampons d’échantillon a provoqué une liaison rapide des complexes anticorps anti-FAM/AuNP avec des FAM isolés et des rapporteurs FB lorsque l’échantillon a migré vers l’avant. Enfin, la streptavidine, immobilisée au niveau de la bande contrôle, a capturé les biotines craquées et les complexes FB reporter/anticorps anti-FAM/AuNP.
Initialement, la bande de contrôle apparaissait en rouge en raison de l’agrégation des AuNPs. Par la suite, le reste des complexes FAM/anticorps anti-FAM/AuNP isolés se sont déplacés vers la bande de test et ont réagi avec les anticorps FAM apparaissant en rouge. Enfin, les amplicons ont activé Cas12a pour cliver tous les reporters FB. Le changement de couleur n’est resté qu’au niveau de la bande de test.
En un mot, lorsque le changement de couleur n’a été observé que dans la bande de test ou à la fois dans le contrôle et la bande de test, il a été considéré comme un résultat positif. En revanche, si le changement de couleur n’était trouvé qu’au niveau de la bande de contrôle, cela indiquait un résultat négatif, c’est-à-dire que l’absence de matrices d’ADN n’entraînait aucun amplicon pour l’activation de Cas12a.
conclusion
Un avantage vital du test RAA-Cas12a-MPXV est qu’il peut être effectué à une température douce par rapport aux processus conventionnels. Surtout, ce test était une méthode de diagnostic MPXV puissante avec une sélectivité, une sensibilité et une portabilité supérieures.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
