Une équipe de scientifiques des États-Unis a récemment mis au point un test moléculaire duplex à un seul tube pour la détection rapide des variantes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) contenant des mutations de pointe E484K et N501Y. Le test ne prend que 2,5 heures pour identifier les variants viraux à partir d’échantillons nasopharyngés. Une description détaillée de la méthode de dosage est actuellement disponible sur le medRxiv* serveur de pré-impression.
Sommaire
Contexte
Le SRAS-CoV-2, l’agent pathogène responsable de la pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), est un virus à ARN monocaténaire à sens positif enveloppé d’une taille de génome d’environ 30 kb. Depuis son émergence en décembre 2019, le SRAS-CoV-2 a subi plus de 12000 mutations en réponse à diverses pressions de sélection, y compris des thérapies antivirales et des réponses immunitaires de l’hôte. Des études portant sur les altérations génomiques du SRAS-CoV-2 ont montré que la plupart de ces mutations se produisent dans la région codant le pic, ce qui facilite par la suite le virus à évoluer indépendamment en plusieurs variantes génomiques. Certaines des variantes nouvellement apparues du SRAS-CoV-2, y compris les variantes B.1.1.7, B.1.351 et P.1, ont été désignées comme variantes préoccupantes (COV) en raison de leur transmissibilité accrue et de leur capacité à se soustraire. réponses immunitaires de l’hôte.
Dans la phase ultérieure de la pandémie de COVID-19, deux mutations de pointe, dont E484K et N501Y, ont attiré une attention significative en raison de leur capacité à augmenter l’interaction entre le pic – enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) et réduire l’efficacité du SRAS- Anticorps neutralisants CoV-2. Les variants du SRAS-CoV-2 contenant ces mutations circulent actuellement en tant que souches virales prédominantes dans de nombreux pays, dont le Royaume-Uni, l’Afrique du Sud, le Brésil et les États-Unis.
Dans la présente étude, les scientifiques ont mis au point un test de génotypage pour identifier rapidement les mutations de signature dans diverses variantes du SRAS-CoV-2. Ils ont utilisé ce test pour cribler des échantillons nasopharyngés prélevés sur des patients atteints de COVID-19.
Dosage moléculaire duplex monotube
Pour identifier les mutations de signature via le génotypage, les scientifiques ont utilisé des sondes d’hybridation d’oligonucléotides, également appelées sondes de balise moléculaire. Pour générer des cibles d’ADN simple brin pour les sondes, ils ont mené une réaction en chaîne asymétrique par polymérase de transcription inverse (RT-PCR) pour amplifier la région du gène de pointe couvrant à la fois les codons 484 et 502. Dans le test, ils ont utilisé deux sondes différentiellement marquées pour le génotypage simultané dans les deux régions génomiques. Sur la base de la conception de la sonde, on s’attend à ce que la séquence de type sauvage produise une température de fusion plus élevée par rapport à celle de la séquence mutée.
En utilisant le test, ils ont génotypé avec succès des séquences virales extraites de différents variants de SARS-CoV-2, y compris une souche de type sauvage, deux variants B.1.1.7, deux variants B.1.351 et un variant récemment émergé contenant la mutation E484K.
En outre, pour identifier les mutations de signature dans les échantillons obtenus par les patients, ils ont effectué le test de génotypage à l’aide d’échantillons nasopharyngiens inactivés par la chaleur et positifs pour le SRAS-CoV-2 prélevés dans 8 hôpitaux différents. Les résultats ont révélé que les proportions de mutations E484K et N501Y dans les échantillons étaient de 8,8% et 8%, respectivement. Cependant, la co-occurrence des deux mutations n’a été observée dans aucun des échantillons testés. Fait intéressant, une nouvelle mutation N501T a été identifiée dans 11 échantillons qui présentaient un profil de fusion significativement différent de celui de la mutation de type sauvage et N501Y.
Avec une analyse plus approfondie, les scientifiques ont observé une forte augmentation de la mutation E484K dans les échantillons collectés en février 2021, alors qu’aucun des échantillons de décembre 2020 ne présentait cette mutation. Une tendance similaire qu’ils ont observée pour la mutation N501Y également.
Pour une validation plus poussée du test de génotypage, les scientifiques ont effectué une analyse de séquençage du génome entier en utilisant un panel de 74 échantillons contenant différents génotypes identifiés par le test de génotypage actuel. L’analyse a révélé une uniformité de 100% entre les résultats du séquençage du génome entier et les résultats actuels du criblage.
Importance de l’étude
L’étude décrit le développement et la validation d’un nouveau test de génotypage qui est très sensible pour identifier les mutations de signature trouvées dans les variantes nouvellement émergées du SRAS-CoV-2. En outre, le test est capable d’identifier de nouvelles mutations qui sont présentes dans les régions de liaison à la sonde.
De manière classique, une analyse de la séquence du génome entier est effectuée pour identifier des mutations dans des variants viraux. Cependant, cette méthode prend du temps et implique des processus d’analyse de données complexes. Avec un délai d’exécution rapide (seulement 2,5 heures), le nouveau test de génotypage fournit une plate-forme de criblage à haut débit pour l’identification rapide des mutations émergentes du SRAS-CoV-2.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
