Dans une étude récente publiée dans La natureles chercheurs ont développé un flux de travail de cartographie des clones génétiques centré sur des bases spécifiques sur place technologie de séquençage (BaSISS) pour dériver des cartes quantitatives de plusieurs clones génétiques de cellules cancéreuses.
Sommaire
Arrière plan
Les cellules cancéreuses ou néoplasiques sont des entités dynamiques qui changent et remodèlent continuellement leurs interactions avec leur microenvironnement. Ces cellules ont de multiples populations sous-clonales, qui sont des groupes de cellules génétiquement liés mais distincts.
Les technologies génomiques, telles que le séquençage du génome entier (WGS), ont détecté des sous-clones mais semblent insuffisantes pour déchiffrer leurs caractéristiques phénotypiques et leurs interactions au sein des écosystèmes tissulaires. Il s’agit d’une limitation majeure car toutes les propriétés des sous-clones du cancer sont des déterminants de la croissance, de la progression, de la récurrence ou des effets indésirables du cancer.
Flux de travail BaSISS
Les sous-clones ciblés par BaSISS ont été identifiés par un arbre phylogénétique dérivé du WGS. Les sondes de cadenas spécifiques à la mutation BaSISS se sont d’abord hybridées à l’ADN complémentaire (ADNc) d’allèles mutants et de type sauvage de variants somatiques définissant le clone sur place. Toutes les sondes de cadenas complètement ciblées et complémentaires ont été ligaturées et ont formé des cercles fermés.
Par la suite, des sondes d’interrogation marquées au fluorophore et une microscopie cyclique ont détecté des codes-barres de lecteur uniques de quatre à cinq nucléotides de sondes ligaturées amplifiées par amplification en cercle roulant permettant le multiplexage. L’équipe a utilisé la modélisation mathématique pour créer des cartes de clones à l’aide de signaux BaSISS et des génotypes de clones.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont récupéré huit blocs de tissus de deux patientes (P1 et P2) qui avaient subi une mastectomie chirurgicale pour un cancer du sein multifocal. Ces échantillons de tissus couvraient trois stades histologiques de la progression précoce du cancer : le carcinome canalaire sur place (CCIS), cancer invasif et métastases ganglionnaires.
Dans trois échantillons de P1, P1-récepteur des œstrogènes (ER) 1, P1-ER2 et P1-D1, les expériences WGS ont identifié des grappes de mutations liées à six branches d’arbre phylogénétique. Les sondes de cadenas BaSISS ont ciblé 51 allèles sur chaque branche d’arbre phylogénétique. L’équipe a identifié un sous-clone par un identifiant de patient et la couleur du nœud d’arbre phylogénétique correspondant.
Notamment, différentes couleurs notées sur P1 dénotaient un nœud. par exemple, P1-violet, P1-rouge, P1-gris, P1-orange, P1-vert et P1-bleu. De même, un génotype de sous-clone comprenait les mutations de branche s’accumulant au fur et à mesure que l’on se déplaçait de la racine de l’arbre au nœud de sous-clone. Par exemple, P1-vert contenait des mutations de branches grises, bleues et vertes.
L’équipe a examiné trois échantillons de cancer du sein primaire (PBC) avec une histologie invasive et CCIS mélangée : P1-ER1, P1-ER2 et P2-triple négatif (TN) 1 pour démontrer que BaSISS pouvait tracer le développement de stades de cancer distincts sur des sections de tissus entières . De plus, les chercheurs ont intégré des données spatiales pour établir comment les changements phénotypiques sont liés aux transitions d’état génétique et d’état histologique.
Le DCIS est connu pour être génétiquement hétérogène, mais la façon dont les clones de DCIS s’organisent et se développent à travers le système de conduits plus large reste incompréhensible. L’équipe a donc examiné trois échantillons de DCIS de P1 (P1-D1, P1-D2 et P1-D3) qui couvraient une surface de tissu de 224 mm2. Enfin, l’équipe a effectué une analyse spatiale de l’expression génique à l’aide de sur place séquençage (ISS).
Résultats de l’étude
Près de 97 % des signaux ponctuels BaSISS détectés ont été convertis en codes-barres compréhensibles. Sa couverture moyenne spécifique à la cible était 13 000 fois plus élevée sur 300 mm2 du tissu mammaire. En outre, les fractions d’allèles variants dérivées de BaSISS présentaient un lien étroit entre des expériences répétées sur des coupes de tissus en série, mettant en valeur sa reproductibilité quantitative. Les signaux BaSISS colorés en fonction de leur branche de mutation sous-clonale ont révélé un aperçu visuel de la structure de croissance sous-clonale.
L’algorithme de cartographie des clones a également ajusté discrètement les fréquences alléliques observées pour une gamme de biais systématiques (par exemple, la sensibilité différentielle de la sonde BaSISS). Pourtant, les fréquences alléliques modélisées par BaSISS étaient en accord avec les données de validation de la microdissection par capture laser (LCM) –WGS.
Conformément aux données WGS en masse, BaSISS a détecté deux à quatre sous-clones par PBC. L’examen quantitatif a révélé que les sous-clones individuels formaient des modèles spatiaux liés à la progression histologique des états cancéreux. Par exemple, dans P1-ER2, une région d’hyperplasie n’était pas génétiquement liée au cancer, comme l’a confirmé le LCM-WGS. Dans chaque CBP, les modèles de progression génétique et histologique étaient largement stables. Le cancer invasif était principalement composé de cellules du sous-clone le plus récemment divergé.
Inversement, les clones divergents antérieurs colocalisaient entièrement ou en partie au DCIS. Cependant, un sous-clone dans chaque PBC couvrait à la fois le CCIS et l’histologie invasive. Il a indiqué que des états de progression histologiques et génétiques distincts pouvaient également exister. Les exemples incluent le clone P1-rouge dans P1-ER1 et le clone P1-violet dans P1-ER2.
En ce qui concerne les changements phénotypiques accompagnant l’invasion du cancer, les chercheurs ont observé que les régions de clones mutants de la phosphatase et de l’homologue de la tensine (PTEN) présentaient une coloration nucléaire de l’immunohistochimie (IHC) Ki-67 plus dense que les régions de type sauvage. La régulation à la hausse de Ki-67, un autre clone génétique, était temporellement liée à l’acquisition d’une mutation PTEN et a précédé l’invasion.
Les cellules épithéliales orange P1 présentaient une expression plus élevée des oncogènes régulateurs du cycle cellulaire cycline D1 (CCND1) et cycline B1 (CCNB1) et de la protéine à doigt de zinc oncogène 3 (ZNF703), qui ont été associés à des résultats cliniques indésirables. Dans l’ensemble, les apparences architecturales et nucléaires et les profils d’expression génique étaient remarquablement spécifiques à la lignée, et leurs différents modèles pouvaient également être visualisés dans l’espace.
Une analyse de l’échantillon P2-LN1 à l’aide de BaSISS a détecté deux clones (P2-bleu et P2-orange) qui formaient des motifs séparés dans l’espace. L’annotation histologique utilisant l’hématoxyline et l’éosine (H&E), l’antigène commun aux lymphocytes (CD45) et les taches de pan-cytokératine a identifié plusieurs modèles de croissance du cancer métastatique. Les auteurs ont noté de fortes associations entre ces deux clones détectés et leurs schémas de croissance histologiques.
En outre, ils ont noté que les modèles d’expression génique spécifiques aux clones de 17/91 gènes se récapitulaient dans de multiples expansions spatialement distinctes sur plus de 1 cm2 du tissu tumoral. Dans l’ensemble, le clone BaSISS cartographie les variations génétiques spatialement liées dans les microenvironnements aux clones individuels.
conclusion
LCM, une technique d’échantillonnage basée sur l’histologie, ne parvient pas à fournir une représentation impartiale des territoires des sous-clones du cancer, en particulier dans les sections de tumeur entière. BaSISS, d’autre part, a interrogé de grandes coupes de tissus à l’échelle du centimètre carré, ce qui a permis d’étudier des coupes transversales entières de tumeurs plus petites. Il est également relativement peu coûteux et ne repose pas uniquement sur des méthodes basées sur WGS.
Pour conclure, BaSISS est un ajout précieux à la boîte à outils spatiale-omique grâce à sa remarquable capacité à localiser spatialement plusieurs sous-clones distincts du cancer et même à les caractériser moléculairement. À l’avenir, son application généralisée pourrait aider à dévoiler comment les cancers se développent dans différents tissus, ce qui, à son tour, pourrait aider à retracer les sous-clones malheureux causant des résultats cliniques indésirables.
