Dans une étude récente publiée dans Maladies infectieuses émergentesles chercheurs ont réalisé des expériences d’isolement du sarbecovirus de chauve-souris en utilisant Rhinolophus cornutus chauves-souris de plusieurs régions du Japon qui étaient phylogénétiquement situées dans le même groupe de virus liés au coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2).
Les bêta-coronavirus humains hautement pathogènes (β-CoV) tels que le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV), le SRAS-CoV-2 et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient CoV (MERS-CoV) ont été considérés comme provenant de chauves-souris. Par conséquent, la surveillance du β-CoV des chauves-souris est essentielle pour améliorer la compréhension et évaluer le potentiel de propagation du β-CoV chez l’homme. Les Sarbecovirus identifiés dans des pays asiatiques tels que la Chine ont été signalés comme étant génétiquement divers ; cependant, les variations génétiques et la distribution des sarbecovirus de chauve-souris au Japon n’ont pas été bien caractérisées et nécessitent des recherches plus approfondies.
Les auteurs de la présente étude ont précédemment montré qu’un pseudotype viral à base de VSV (virus de la stomatite vésiculeuse) comprenant la protéine S (spike) du sarbecovirus Rc-o319 de R. cornutus infecté uniquement les cellules exprimant Rc-ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine 2), mais pas les cellules exprimant l’ACE2 humain (hACE2) ou autre Rhinolophus Cellules exprimant l’ACE2.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont rendu compte de l’identification, de l’isolement et de la caractérisation biologique et génétique des sarbecovirus provenant de chauves-souris dans différents endroits japonais.
Des échantillons de matières fécales ont été prélevés sur R. ferrumequinum et R. cornutus chauve souris espèces dans les préfectures de Chiba, Shizuoka et Niigata. Une RT-PCR en temps réel (réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse) a été réalisée et l’équipe a établi des cellules Vero exprimant RcACE2 (Vero-RcACE2) basées sur la protéase Vero/transmembranaire scellules érine 2 (TMPRSS2).
Une analyse de séquençage de nouvelle génération (NGS) a été effectuée pour déterminer la séquence du génome entier de tous les isolats viraux, et les séquences ont été déposées dans GenBank. De plus, une analyse de tracé de similarité a été effectuée pour la séquence complète du génome en utilisant chaque isolat comme requête. Un arbre phylogénétique a été construit des sarbecovirus de chauve-souris au Japon sur la base de séquences du génome entier avec l’analyse de vraisemblance maximale et des répliques amorcées.
Les S RBM (receptor-binding motif) des isolats de chauves-souris du Japon ont été alignés avec ceux d’autres sarbecovirus. Pour évaluer la cinétique de croissance des isolats de sarbecovirus de chauves-souris au Japon, R. cornutus les isolats de chauve-souris Rc-os20, Rc-o319, Rc-mk2 et Rc-kw8 ou SARS-CoV-2 (souche B.1.1.7) ont été inoculés dans Vero-RcACE2 [RcACE2, Vero/TMPRSS2 (WT)]Vero-hACE2 (hACE2) ou Vero-ACE2KO (ACE2KO) et les titres viraux ont été déterminés à l’aide d’essais sur plaque.
Résultats
Les isolats ont montré une croissance efficace dans les cellules qui exprimaient Rhinolophus cornet ACE2 mais ne s’est pas bien développé dans les cellules exprimant hACE2, indiquant que les isolats de chauve-souris avaient une gamme étroite d’hôtes. L’analyse RT-PCR a permis de détecter avec succès la séquence du gène d’enveloppe (E) des sarbecovirus dans un ou deux Rhinolophus cornutus échantillons dans chaque préfecture. Les sarbecovirus de chauve-souris ont été isolés avec succès en utilisant des cultures de cellules Vero-RcACE2, avec d’énormes effets cytopathiques et la formation de syncytium à partir d’échantillons positifs pour la RT-PCR de fèces de chauve-souris de chaque préfecture.
Les isolats de chauves-souris des préfectures de Shizuoka, Niigata et Chiba ont été désignés respectivement Rc-kw8, Rc-os20 et Rc-mk2. De plus, Rc-o319 a été isolé en utilisant des cultures de cellules Vero-RcACE2. A l’opposé, tout échantillons de Rhinolophus ferremuquinum espèces étaient négatives, indiquant que les sarbecovirus de chauve-souris étaient répartis entre Rhinolophus cornutus chauves-souris au Japon. Les séquences de toutes les souches de chauves-souris isolées du Japon étaient hautement homologues (entre 95 % et 97 %). Cependant, Rc-os20 et Rc-mk2 manquaient de la région codant pour ORF8 (cadre de lecture ouvert 8).
L’équipe a observé des similitudes élevées parmi les isolats de chauve-souris tout au long de la séquence du génome, à l’exception des sites codant pour le domaine de liaison au récepteur du gène S (RBD) et le domaine N-terminal (NTD). Cependant, les MTN Rc-kw8 et Rc-o319 se sont révélées être conservées. Aucune recombinaison significative n’a été observée parmi les isolats de chauves-souris. Dans l’analyse phylogénétique, les isolats ont été observés dans un groupe génétique situé dans un clade génétique comprenant des sarbecovirus apparentés au SRAS-CoV-2.
Les résultats de l’analyse phylogénétique S RBD ont indiqué que les isolats du Japon se positionnaient dans le clade génétique d’organismes viraux utilisant des molécules orthologues ACE2 comme récepteurs. Par conséquent, l’équipe a supposé que les nouvelles souches isolées du Japon utilisent RcACE2 comme récepteurs. Les isolats de chauve-souris se sont répliqués efficacement uniquement dans les cellules Vero-RcACE2 mais pas dans les cellules Vero-ACE2KO, Vero/TMPRSS2 ou Vero-hACE2. Les résultats ont indiqué que les isolats de chauves-souris dépendaient de RcACE2 pour leur infectivité.
En revanche, le SRAS-CoV-2 a montré une réplication efficace dans les cellules Vero-RcACE2, Vero-hACE2 et les cellules Vero/TMPRSS2, mais ne s’est pas bien reproduit dans les cultures de cellules Vero-ACE2KO, indiquant que leur infectivité dépendait de la présence de plusieurs récepteurs ACE2, y compris ceux de Rhinolophus cornutus chauves-souris. Les résultats ont indiqué que les isolats de chauves-souris du Japon n’utilisaient que bRcACE2 comme récepteurs.
La majorité des séquences génomiques parmi les souches du Japon étaient hautement conservées, ce qui pourrait être depuis Rhinolophus spp. les espèces de chauves-souris migrent sur des distances relativement courtes et n’ont pas fréquemment de contact croisé avec d’autres groupes de chauves-souris. Les exceptions étaient les régions S codant pour RBD et NTD, qui présentaient une variation génétique importante due aux pressions immunologiques, indiquant que les chauves-souris ont divergé de la souche ancestrale ces derniers temps.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que les isolats de chauves-souris utilisaient batACE2 sous la forme de récepteurs sans réplication dans les cellules exprimant hACE2, étant donc un type caractéristique et indiquant un potentiel d’infection humaine rare. Les Sarbecovirus peuvent muter et entraîner des infections humaines par le biais d’espèces hôtes intermédiaires dans le bétail ou la faune. Par conséquent, des études sur l’épidémiologie des sarbecovirus chez les animaux sauvages, y compris les chauves-souris, doivent être menées avec des évaluations des risques à long terme de leur potentiel de transmission zoonotique.
