Causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a fait peser un lourd fardeau sur les systèmes de santé à travers le monde. À ce jour, le virus a infecté plus de 105,94 millions de personnes et entraîné plus de 2,3 millions de décès dans le monde.
La montée en flèche des cas provoqués par la deuxième et les vagues successives ont presque submergé les systèmes de santé dans des pays comme les États-Unis et le Royaume-Uni, soulignant la nécessité d’un diagnostic et d’un traitement rapides. Bien que des vaccins soient déjà en cours de déploiement dans de nombreux pays, l’immunité de la population mondiale reste encore loin.
Des chercheurs du centre médical de l’Université du Nebraska ont développé une stratégie bactérienne pour l’expression et la purification du domaine de liaison au récepteur de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 (RBD).
L’étude, publiée sur la pré-impression medRxiv * serveur, a montré qu’il est possible de produire rapidement et à peu de frais des antigènes fonctionnels et actifs dans des bactéries pour suivre et se lier au récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) ainsi qu’à des anticorps dans les sérums de patients COVID-19.
Domaine de liaison au récepteur SARS-CoV-2 (RBD)
Le virion du SRAS-CoV-2 contient quatre protéines structurelles: le pic (S), l’enveloppe (E), la membrane (M) et la nucléocapside (N). La protéine S agit en protégeant et en recouvrant la surface du SRAS-CoV-2 tout en permettant au virus d’échapper au système immunitaire de l’hôte et de pénétrer dans les cellules humaines. La fixation du virus au récepteur repose sur le domaine de liaison au récepteur (RBD), qui est également responsable de l’induction de la production d’anticorps neutralisants dans le corps.
Par conséquent, le RBD a été une cible très étudiée pour le développement de vaccins et de médicaments. L’interaction du récepteur RBD et ACE2 est un événement important avant l’infection virale. Des études antérieures ont montré que la RBD se lie au récepteur ACE2 à faible affinité nanomolaire, mettant en évidence les régions clés de la RBD qui sont responsables de la liaison de l’ACE2.
Le RBD contient des feuilles β étendues avec une insertion étendue appelée motif de liaison au récepteur (RBM), qui se compose des résidus qui entrent en contact avec ACE2. Outre les feuillets β, le RBD contient également dix cystéines, qui peuvent stabiliser la structure globale en formant cinq liaisons disulfure.
L’équipe a noté que toutes ces liaisons ne sont pas formées consécutivement, alors que certaines nécessitent une édition par réduction et réoxydation pour générer les liaisons correctes, ce qui peut poser un problème de pliage compliqué dans le cytoplasme bactérien.
Production de protéines couchées dans les bactéries
Les tentatives pour obtenir une protéine recombinante à l’aide de systèmes d’expression procaryotes peuvent être une procédure rapide et enrichissante, mais elle peut être difficile. Dans la plupart des cas, la production de protéines hétérologues Escherichia coli souches est restée une méthode expérimentale.
Bien que l’utilisation de cette bactérie soit bénéfique en termes de facilité de production, de rentabilité et de croissance rapide, cela peut être une tâche ardue. Il est essentiel de maintenir les liaisons disulfure correctes pour la stabilité structurelle et fonctionnelle, ce qui peut être problématique lors de l’expression de protéines d’intérêt dans le cytoplasme de E. coli.
Le laboratoire Ruddock a développé le CyDisCo (formation de liaison disulfure cytoplasmique en E. coli) système qui peut produire des protéines à liaison disulfure actives dans le cytoplasme des bactéries sans supprimer les systèmes de réduction. Il exprime la sulfhydryl oxydase Evr1p.
Pendant le repliement des protéines, une nouvelle enzyme appelée protéine disulfure isomérase (PDI) est ajoutée pour modifier les liaisons disulfure. Le PDI peut différencier les protéines correctement repliées des protéines mal repliées et corriger les liaisons disulfure via des cycles de clivage et de formation. Par conséquent, des protéines correctement et correctement repliées avec des liaisons disulfure peuvent être produites dans le E. coli cytoplasme.
Gels SDS-PAGE de purification de protéines. RBD-MBP peut être observé fonctionnant à 74 kDa, comme indiqué par les flèches noires près du marqueur de 75 kDa. Des flèches noires à environ 42 kDa pourraient indiquer une MBP produite ou clivée de manière endogène. A) Expérience d’induction initiale comparant l’induction le même jour (4 h) à 30 ° C et l’induction pendant une nuit (16 h) à 18 ° C. B) Fractions MBPTrap AKTA. C) Fractions AKTA d’affinité avec le nickel. D) Fractions AKTA d’exclusion de taille.
Dans l’étude, les chercheurs ont utilisé le système CyDisCo pour produire une RBD de pointe de SARS-CoV-2 recombinante qui est correctement repliée avec des liaisons disulfure correctes. L’équipe a noté que la méthode est un moyen plus simple et économique de générer des antigènes à l’aide d’un système d’expression bactérien, qui peut être utilisé dans des tests de diagnostic et des dosages.
Pour arriver aux résultats de l’étude, l’équipe a développé une nouvelle méthode plus rapide pour exprimer et purifier l’antigène RBD fonctionnellement actif dans E. coli. L’équipe a également découvert que la RBD fusionnée à la protéine de liaison au maltose (MBP) était reconnue par des anticorps humains spécifiques au SARS-CoV-2, comme confirmé par un test immunologique.
La coexpression de la sulfhydryl oxydase, Evr1p, et de l’isomérase de liaison disulfure, PDI dans le système CyDisCo avec le plasmide d’intérêt résulte en une protéine bien repliée et fonctionnellement active dans un système bactérien, ce qui est simple, rapide et moins coûteux qu’un système eucaryote ou mammifère », ont conclu les chercheurs dans l’étude.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
