Dans une récente étude publiée sur Place de la recherche* serveur de préimpression, les chercheurs ont identifié les facteurs antiviraux de l’hôte et les voies régulant l’infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2).
Comme d’autres coronavirus (CoV), le SRAS-CoV-2 détourne les facteurs (cellulaires) de l’hôte pour compléter le cycle d’infection. L’interaction virus-hôte et les dépistages génétiques ont fait progresser notre compréhension du SRAS-CoV-2. Dans les cribles génétiques, l’impact de la perturbation médiée par l’ARN guide (ARNg) de courtes répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en grappes (ARNg) d’un gène hôte est évaluée en réponse aux effets cytopathiques médiés par l’infection (CPE). Les gènes qui affectent de manière significative le CPE sont considérés comme des facteurs hôtes pro- ou antiviraux.
L’étude et les conclusions
La présente étude a effectué un dépistage d’abandon CRISPR à l’échelle du génome pour identifier les facteurs antiviraux de l’hôte physiologiquement pertinents. Tout d’abord, un criblage de perte de fonction (LOF) à l’échelle du génome a été réalisé sur la base d’un CPE induit par le virus, en utilisant la lignée cellulaire A549-AC avec une expression constitutive de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (ACE2) et de la protéine 9 associée à CRISPR. (Cas9).
Les cellules avec des ARNg ciblant les facteurs hôtes pro-viraux seraient enrichies après l’infection, tandis que les cellules avec des ARNg pour les facteurs antiviraux s’épuiseraient. Pour atteindre un taux de destruction de 50% à 80%, les cellules ont été infectées avec une multiplicité variable d’infection (MOI) et évaluées pour la viabilité 48 heures après l’infection (hpi).
Un MOI de 4,24 a donné 50 % de destruction à 48 hpi ; ainsi, un MOI de 5 a été utilisé pour le dépistage. L’écran d’abandon a atteint un taux de destruction de 47 % et avait des lectures d’ARNg adéquates pour tous les échantillons. Les auteurs ont calculé le changement de fréquence de l’ARNg dans les cellules infectées et non infectées. Sur la base d’une coupure spécifique de la fréquence de l’ARNg, 63 gènes enrichis et 84 gènes appauvris ont été identifiés, les qualifiant respectivement de succès pro- et antiviraux.
L’analyse de Gene Ontology a révélé que les hits pro-viraux provenaient de voies impliquées dans la réplication virale, l’endocytose, la maturation des phagosomes et l’autophagie. D’autre part, les hits antiviraux provenaient de voies impliquées dans l’assemblage du complexe ARN polymérase II de l’hôte et l’entrée et la sortie virales.
Ensuite, ils ont généré un réseau d’interaction protéine-protéine (PPI) de plus de 13 000 protéines hôtes et 30 protéines virales. Par la suite, des sous-réseaux couvrant 147 hits CRISPR et 26 protéines virales ont été construits. Trois principaux sous-réseaux PPI hôtes ont été identifiés.
Le premier sous-réseau antiviral comprenait des sous-unités du complexe cohésine, y compris le maintien structurel des chromosomes 3 (SMC3), SMC1A et RAD21. Le deuxième sous-réseau était composé de composants des complexes de tri endosomal nécessaires à la voie de transport (ESCRT). Le troisième sous-réseau était lié à c-MYC et à des protéines en interaction telles que la protéine associée au domaine de transformation/transcription (TRRAP).
De plus, l’analyse de sous-réseau a identifié les sous-unités d’ATPase de type vacuolaire (V-ATPase) telles que ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1A et ATP6V1B2 comme facteurs pro-viraux. En outre, un réseau d’interaction ARN-protéine (RPI) entre les protéines hôtes et l’ARN du SRAS-CoV-2 a été construit. Les résultats de l’écran CRISPR interagissant avec l’ARN du SRAS-CoV-2 ont été regroupés en deux catégories.
La première catégorie était celle des protéines de liaison au polyadénylate, comprenant un facteur antiviral et quatre facteurs proviraux. La deuxième catégorie comprenait des régulateurs positifs de la sécrétion d’exosomes, avec deux facteurs proviraux et un facteur antiviral.
De plus, les données de l’écran d’abandon CRISPR ont été intégrées aux résultats de l’analyse des études d’association à l’échelle du génome COVID-19 (GWAS). Cela a révélé que les variations génétiques des facteurs hôtes identifiés étaient significativement associées aux patients COVID-19 critiques/hospitalisés. L’équipe a également observé que TRRAP, SMC3 et ATP6V1B2 étaient associés à une hospitalisation liée au COVID-19, ce qui suggère la pertinence clinique du COVID-19.
Le facteur 5 de type Kruppel (KLF5) était également associé à une COVID-19 sévère et à une hospitalisation. L’équipe a extrait les profils transcriptionnels des hits identifiés à partir d’ensembles de données publiés de séquençage d’ARN unicellulaire (scRNA-seq) de cellules des voies respiratoires de patients COVID-19 et a comparé les différences entre les patients atteints de COVID-19 léger et sévère. Sur les 147 accès à l’écran CRISPR, 59 ont été exprimés de manière différentielle entre les deux groupes.
La concordance des changements de gènes différentiellement exprimés (DEG) entre le scRNA-seq et les données de dépistage CRISPR a été examinée, en supposant que les facteurs hôtes pro et antiviraux seraient régulés à la hausse et à la baisse, respectivement, chez les patients atteints de COVID-19 sévère. Vingt-quatre facteurs hôtes proviraux et huit facteurs antiviraux ont présenté une régulation positive et négative concordante chez les patients atteints de COVID-19 sévère par rapport à ceux atteints d’une maladie bénigne.
L’équipe a choisi cinq gènes recensés dans l’écran de CRISPR pour évaluer leurs rôles dans l’infection SARS-CoV-2. Ces gènes ont été éliminés dans la lignée cellulaire A549-AC, et l’inactivation (KO) a été confirmée par réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR) et Western blot. Les cellules A549-AC exprimant ces ARNg ont été infectées par le SARS-CoV-2.
Le KO des facteurs hôtes pro-viraux (DPAGT1 ou ATP6V0D1) a augmenté la viabilité cellulaire, tandis que le KO des facteurs hôtes antiviraux (KLF5, DAZAP2 ou VTA1) a entraîné une viabilité cellulaire réduite. Seulement VTA1 ou DAZAP2 ont été surexprimés avec succès (OE) dans la lignée cellulaire A549-AC. DAZAP2 la surexpression a augmenté la viabilité des cellules infectées par le SRAS-CoV-2, alors que VTA1 la surexpression n’a pas eu d’impact sur la viabilité cellulaire.
Les cellules OE ou KO ont été incubées avec le SARS-CoV-2 à 4 °C, ce qui a permis une fixation virale sans entrée et a quantifié le nombre de virions attachés par PCR en temps réel. Fait intéressant, seules les cellules DPAGT1-KO présentaient une amélioration modérée de l’attachement viral, mais pas dans les autres cellules OE ou KO. De plus, les cellules OE ou KO ont également été incubées avec le SARS-CoV-2 à 37 °C, permettant la fixation et l’entrée du virus dans les cellules. Constamment, les cellules DPAGT1-KO ont amélioré l’entrée virale. Ceci a indiqué que seul DPAGT1 a facilité l’attachement et l’entrée de SARS-CoV-2.
Enfin, l’équipe a quantifié la réplication virale dans les cellules OE ou KO à l’aide du SARS-CoV-2 exprimant la nanoluciférase (SARS-CoV-2-Nluc). Ils ont observé une réplication significativement réduite dans les cellules avec KO de ATP6V0D1 ou DPAGT1, tandis qu’une réplication accrue a été observée dans les cellules avec KO de VTA1, DAZAP2 ou KLF5. Au contraire, les cellules avec surexpression de DAZAP2 ou VTA1 ont présenté une réplication virale réduite, confirmant leur effet antiviral.
conclusion
En résumé, les auteurs ont effectué des écrans d’abandon CRISPR à l’échelle du génome et ont intégré les résultats de l’écran d’abandon avec GWAS, les interactomes de protéines virales et d’ARN et les profils transcriptionnels des cellules des patients COVID-19. En outre, ils ont confirmé 25 résultats par validation génétique individuelle. Notamment, 54 % des facteurs pro-viraux et 87 % des facteurs antiviraux de l’hôte n’étaient pas identifiés auparavant, ce qui souligne l’importance du dépistage de l’abandon.
Le dépistage du décrochage génétique et l’analyse intégrée de la base de données ont révélé de nombreuses nouvelles molécules/voies, notamment le complexe cohésine, les V-ATPases et d’autres voies vitales qui modulent la réplication virale et la manifestation de la maladie.
*Avis important
Research Square publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
