Dans une étude récente publiée dans le Pathogènes PLOS journal, les chercheurs ont étudié les interactions entre la sirtuine 5 (SIRT5) et la protéine non structurale du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère (Nsp14).
L’enzyme hautement conservée appelée SARS-CoV-2 Nsp14 est essentielle à la réplication virale. La protéine non structurale Nsp14 a une activité exoribonucléase et N7-méthyltransférase et forme un complexe stable avec Nsp10. Le SIRT5 humain a été trouvé dans des enquêtes sur l’interactome protéine en tant que partenaire de liaison potentiel de Nsp14.
La protéine désacylase SIRT5 dépendante de la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) s’est avérée dépouiller les groupes succinyle et malonyle des résidus de lysine, ce qui est essentiel pour le métabolisme cellulaire.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont évalué les caractéristiques de l’interaction SARS-CoV-2 Nsp14 et SIRT5 et la fonction de SIRT5 dans l’infection par le SARS-CoV-2.
L’équipe a d’abord validé et défini la nature de l’interaction Nsp14-SIRT5. Le vecteur d’expression mammifère Nsp14-strep a été utilisé pour la purification par affinité. Après avoir été transfectées dans des cellules HEK-293T avec Nsp14-strep ou un contrôle de protéine fluorescente verte (GFP) pendant 48 heures, les protéines marquées ont été extraites.
Les altérations de la stabilité thermique de Nsp14 et SIRT5 dans des cellules viables ont ensuite été mesurées à l’aide du test de décalage thermique cellulaire (CETSA). Le changement de stabilité thermique a été mesuré par Western blot après que les plasmides d’expression Nsp14 et SIRT5 ont été transfectés dans des cellules HEK-293T, soit séparément, soit ensemble.
L’étude a également déterminé si Nsp10 et SIRT5 étaient des composants de complexes séparés ou s’ils interagissaient également. En utilisant l’interférence de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) groupées dans les cellules HEK-293T, l’équipe a créé une lignée cellulaire renversée SIRT5 (SIRT5-KD) pour supprimer l’expression endogène de SIRT5. Un seul acide ribonucléique (ARN) guide a été choisi après en avoir testé plusieurs autres tout au long de l’enquête. Dans les cellules SIRT5-KD, les plasmides d’expression correspondant à SIRT5, Nsp14-strep et Nspl0 avec une étiquette Flag (Nsp10-Flag) ont été transfectés individuellement ou collectivement pendant 48 heures. La suppression d’un groupe succinyle, malonyle ou glutaryle potentiel de Nsp14 était l’hypothèse principale sur la façon dont SIRT5 pourrait altérer la protéine Nsp14.
Résultats
L’étude a montré que les Western blots confirmaient les résultats antérieurs de la spectrométrie de masse en démontrant que SIRT5 était particulièrement co-purifiant avec Nsp14. Nsp14 et SIRT5 co-localisés dans les mêmes compartiments cellulaires, avec une prédominance de localisation cytoplasmique et périnucléaire, comme le démontre en outre l’immunofluorescence observée dans les cellules épithéliales basales alvéolaires humaines A549 transfectées avec le plasmide d’expression Nsp14.
Lorsque les deux protéines ont été co-transfectées, les chercheurs ont remarqué une amélioration significative de la stabilité des deux protéines. Lorsqu’il était transfecté seul, Nsp14 était faiblement exprimé et à peine visible. Cependant, SIRT5 a permis un signal robuste. Au total, ces résultats préliminaires ont démontré que SIRT5 et Nsp14 interagissaient dans les cellules humaines et que SIRT5 stabilisait de manière significative l’expression de Nsp14.
La purification par affinité Strep (Strep-AP) a confirmé les interactions de SIRT5 et Nsp10 avec Nsp14. Cependant, l’utilisation de Flag-IP pour supprimer Nsp10 a révélé que seule Nsp14 était co-purifiée avec Nsp10. Cela a démontré que Nsp10 et SIRT5 n’interagissaient pas. L’équipe a également émis l’hypothèse que Nsp10 et SIRT5 étaient en compétition directe pour la liaison de Nsp14 car le signal SIRT5 après Strep-AP semblait être diminué en présence de Nsp10. Étant donné que SIRT5 et Nsp10 pourraient se lier de manière compétitive à Nsp14, il a été prédit que Nsp14/SIRT5 et Nsp14/Nsp10 formeraient des complexes différents.
L’équipe a également observé que des gènes tels que Y102 et T105 interagissaient avec les chaînes acides étendues des groupes succinyle ou malonyle, Q140 et I142 étaient impliqués dans la liaison du NAD et H158 était catalytiquement nécessaire pour éliminer un proton du NAD. H158, Q140 et I142 sont conservés dans toutes les sirtuines ; cependant, Y102 et T105 spécifiques à SIRT5 ont assuré la sélectivité vis-à-vis des groupes acides à chaîne plus longue.
La liaison de SIRT5 a été complètement perdue chez les mutants H158Y et Q140A et n’a été que partiellement récupérée dans la mutation Y102F. Cette découverte a démontré que l’interaction avec Nsp14 nécessitait un domaine catalytique SIRT5 intact. La stabilité des mutants catalytiques surexprimés n’a pas été affectée par le traitement des cellules HEK293T avec l’inhibiteur de protéasome MG-132, ce qui a indiqué que les différentes protéines pouvaient se replier correctement.
L’équipe a observé que SIRT1 et Nsp14 interagissaient, mais aucune interaction n’a été observée avec SIRT2, SIRT3, SIRT6 ou SIRT7. Le signal SIRT1 semblait être plus faible que le signal SIRT5. Notamment, à l’instar des découvertes de SIRT5, la mutation du domaine catalytique de SIRT1 ou le traitement de cellules avec Ex-527, un inhibiteur de SIRT1, a bloqué l’interaction. Cela indiquait que l’activité catalytique de SIRT1 était essentielle pour l’interaction Nsp14. D’autre part, le traitement des cellules avec un activateur SIRT1 spécifique tel que SRT1720 ou un activateur non spécifique tel que le resvératrol n’a entraîné aucun impact évaluable sur la liaison de Nsp14. Alors que ces deux activateurs ont montré une toxicité cellulaire à des concentrations élevées, la réduction de la liaison notée après purification par affinité était associée à une diminution des niveaux de SIRT5 et Nsp14 dans les voies d’entrée.
L’équipe a également observé que SIRT5 n’était pas présent dans les cellules SIRT5-KO. La RT-qPCR a mesuré l’ARN viral après trois jours dans les cellules SARS-CoV-2 de type sauvage (WT) et SIRT5-KO suite à une infection par la souche SARS-CoV-2 Wuhan à un MOI de 0,1 et 1. Notamment, un deux à trois Une réduction d’un facteur a également été trouvée dans l’ARNm du SRAS-CoV-2 dans les cellules SIRT5-KO aux deux MOI. Ces résultats suggèrent que SIRT5 était essentiel pour la réplication et/ou la propagation du SARS-CoV-2.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont démontré que SIRT5 interagissait avec la protéine virale Nsp14 et que cette interaction se produisait sans l’implication de Nsp10.
