Dans une étude récente publiée dans la revue Microbiologie naturelle, un groupe de chercheurs a identifié et caractérisé BilR, une nouvelle enzyme dérivée du microbiote intestinal, et a exploré son rôle dans la réduction de la bilirubine en urobilinogène, crucial pour maintenir l’homéostasie de la bilirubine chez l’homme.
Arrière-plan
La bilirubine, un sous-produit clé de la dégradation de l’hème, est cruciale en physiologie humaine, en particulier dans l’axe intestin-foie. Sécrété dans l’intestin, il est soit excrété, soit réabsorbé après déconjugaison par les bêta-glucuronidases.
Les micro-organismes intestinaux le métabolisent davantage en urobilinogène et en stercobilinogène excrétables, affectant ainsi les taux de bilirubine sérique et la santé. Des niveaux modérés de bilirubine agissent comme des antioxydants, mais des niveaux élevés peuvent provoquer une jaunisse ou un ictère nucléaire.
Les microbes intestinaux réduisent de manière unique la bilirubine en urobilinogène, un processus essentiel dans l’homéostasie de la bilirubine. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pleinement les mécanismes par lesquels BilR et d’autres enzymes microbiennes intestinales influencent le métabolisme de la bilirubine et leurs implications plus larges pour la santé humaine, en particulier dans des contextes pathologiques.
À propos de l’étude
Les méthodes utilisées dans cette étude impliquaient une combinaison de criblage expérimental, de génomique comparative et d’essais de fluorescence pour identifier l’enzyme bilirubine réductase, BilR. L’équipe a émis l’hypothèse que l’enzyme responsable de la réduction de la bilirubine est une oxydoréductase agissant sur les doubles liaisons carbone-carbone.
Ils ont recherché des gènes codant pour cette enzyme dans des espèces microbiennes intestinales, en se concentrant sur ceux présents chez les espèces capables de réduire la bilirubine et absents chez celles qui ne le sont pas. À l’aide de tests de fluorescence, les chercheurs ont testé des extraits de diverses bactéries cultivées dans des milieux enrichis en bilirubine.
Ces tests étaient basés sur le principe selon lequel les produits potentiels instables de l’urobilinogène, de la réduction de la bilirubine et du stercobilinogène pouvaient être oxydés en formes plus stables et détectés par fluorescence, tandis que la bilirubine non liée aux protéines n’est pas fluorescente.
Les chercheurs ont identifié une activité de réduction de la bilirubine dans neuf souches, dont trois jusqu’alors inconnues pour cette capacité. Tous les réducteurs appartenaient à la classe Clostridia du phylum Firmicutes. Une analyse génomique comparative a ensuite été menée sur cinq souches réductrices de bilirubine et cinq souches non réductrices étroitement apparentées.
Cette analyse a révélé deux orthogroupes correspondant aux modèles de présence et d’absence correspondant au phénotype de réduction de la bilirubine. L’une d’elles était une enzyme non annotée, homologue de la 2,4-diénoyl-CoA réductase, une oxydoréductase réduisant les doubles liaisons carbone-carbone, semblable à la réaction attendue de réduction de la bilirubine.
Par la suite, l’équipe a analysé les opérons contenant ces bilirubine réductases putatives, identifiant trois versions d’un opéron putatif de bilirubine réductase. Ces opérons comprenaient différentes combinaisons de trois gènes, bilQ, bilR et bilS. Le gène bilR a été identifié comme la bilirubine réductase putative, le bilS comme une protéine de type flavodoxine et le bilQ comme un régulateur transcriptionnel. Des variations dans ces opérons ont été trouvées entre différentes souches, certaines possédant les trois gènes et d’autres seulement un ou deux.
Pour valider expérimentalement le rôle de BilR dans la réduction de la bilirubine, l’équipe a exprimé les gènes bilRS et bilR dans Escherichia coli (E. coli) et utilisé des tests de fluorescence, une chromatographie liquide et une spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour confirmer la réduction de la bilirubine en urobilinogène. Ces tests ont montré une fluorescence significative et la présence d’urobiline dans les échantillons transformés avec les gènes BilRS, confirmant ainsi que BilR est capable de réduire la bilirubine en urobilinogène.
Résultats de l’étude
Les premières expériences de l’étude se sont concentrées sur l’identification d’espèces microbiennes dotées de capacités de réduction de la bilirubine. À l’aide d’un test de fluorescence sur des bactéries cultivées dans des milieux enrichis en bilirubine, les chercheurs ont identifié des espèces susceptibles de réduire la bilirubine.
Clostridioides difficile le groupe de différenciation 3 (CD3), un réducteur de bilirubine connu, a servi de contrôle positif. Ce test a révélé une activité de réduction de la bilirubine chez neuf souches, dont trois qui n’étaient pas reconnues auparavant comme réducteurs de la bilirubine : Clostridium symbiosum, Clostridium sp. M62/1, et Ruminococcus gnavus CC55_001C.
L’analyse génomique comparative a été réalisée sur cinq souches réductrices de bilirubine et cinq souches non réductrices étroitement apparentées. Parmi les 6 256 orthogroupes identifiés, 389 étaient des oxydoréductases prédites, mais seulement deux correspondaient au modèle de présence ou d’absence associé à la réduction de la bilirubine. L’un d’eux était homologue à la 2,4-diénoyl-CoA réductase, une enzyme réduisant les doubles liaisons carbone-carbone, s’alignant sur la réaction attendue de réduction de la bilirubine.
L’analyse des opérons contenant des bilirubine réductases putatives a identifié trois versions d’un opéron putatif de bilirubine réductase, comprenant les gènes bilQ, bilR et bilS. BilR, identifié comme la bilirubine réductase putative, différait par sa constitution génétique selon les espèces.
Dans Ruminococcus gnavus CC55_001C, BilR avait deux domaines C-terminaux supplémentaires, un domaine de type flavodoxine et un domaine de liaison au nicotinamide adénine dinucléotide phosphate d’hydrogène (NADPH). Cette structure suggère un rôle potentiel dans le transfert d’électrons.
Pour valider BilR en tant que bilirubine réductase, les gènes de Clostridium symbiosum, Clostridioides difficile, et Ruminococcus gnavus étaient exprimés de manière hétérologue dans E. coli. Le test de fluorescence et l’analyse LC-MS/MS ont confirmé la réduction de la bilirubine en urobilinogène, indiquant la suffisance de BilR pour catalyser cette réaction.
De plus, en identifiant les résidus clés, l’étude a délimité les séquences BilR d’autres membres de la famille Old Yellow Enzyme. Un clade particulier, le clade 1, était probablement le clade de la bilirubine réductase. Cela a été confirmé par des expériences fonctionnelles sur les résidus mutés D166 et R167, cruciaux pour la réduction de la bilirubine. La protéine mutée a montré une activité nettement inférieure, confirmant l’importance de ces résidus dans le processus de réduction.
L’étude a également étudié la distribution taxonomique des bilirubines réductases, les trouvant principalement chez les espèces Firmicutes. L’analyse suggère que la réduction de la bilirubine pourrait être spécifique à la souche chez certaines espèces, avec des variantes distinctes de bilR largement réparties dans plusieurs phylums.
Enfin, une analyse des métagénomes intestinaux humains a révélé que la bilirubine réductase était souvent absente dans les intestins des nourrissons au cours des premiers mois de la vie, ce qui est en corrélation avec la période de risque d’ictère néonatal. En revanche, il était presque universellement présent dans les échantillons d’adultes en bonne santé.
L’absence de bilirubine réductase était significativement plus élevée chez les patients atteints de la maladie de Crohn ou de colite ulcéreuse, reliant les modifications taxonomiques microbiennes des maladies inflammatoires à une réduction altérée de la bilirubine dans le microbiome intestinal.
