Dans une étude récente publiée dans le Journal de chimie biologique, les chercheurs ont effectué une in vitro analyse pour isoler les chaînes lourdes bovines ultralongues qui ont montré une liaison avec le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) et les coronavirus apparentés (CoV).
Arrière plan
Des études ont rapporté que les anticorps largement neutralisants (Abs) ont un immense potentiel en tant qu’agents thérapeutiques antiviraux en raison de leur capacité à identifier des épitopes hautement conservés rarement mutés dans des variantes virales. Un sous-ensemble d’Ab bovin possède une région ultralongue déterminant la complémentarité (CDR) H3 très apte à identifier les épitopes viraux conservés ; cependant, leur activité contre les protéines de pointe (S) de Sarbecovirus n’a pas été bien caractérisée et justifie une enquête plus approfondie.
À propos de l’étude
Dans la présente étude de preuve de principe, les chercheurs visaient à isoler des chaînes lourdes bovines ultralongues qui pourraient se lier aux protéines Sarbecovirus S in vitro.
Un criblage de surface cellulaire de mammifère a été utilisé pour cribler des bibliothèques d’Ac CDRH3 ultralongs. Des exons variables d’ADNg de leucocytes (acide désoxyribonucléique génomique) de vaches ont été amplifiés pour générer une banque de paratopes bovins ultralongs. Par la suite, l’enrichissement des régions CDRH3 ultralongues a été réalisé par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et sélection des tailles, pour produire une bibliothèque avec des CDRH3 ultralongs.
Ensuite, l’équipe a inséré les amplicons dans la cassette pBovShow. Il a criblé la bibliothèque de protéines de fragments variables à chaîne unique ultralongs (scFv) pour identifier la liaison SARS-CoV-2 S en transfectant de manière transitoire la bibliothèque scFv dans les cellules 293T et en effectuant une analyse FC. Pour augmenter l’efficacité d’isolement des scFv(s) de liaison S, la bibliothèque a été clonée dans des vecteurs LV (lentivirus) et des particules LV pseudotypées par le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) ont été générées et transduites dans les cellules 293T pour obtenir des séquences scFv combinées pour chaque cellule.
Un total de 15 SCC (clones unicellulaires) ont montré une interaction S, dont trois contenaient trois scFv avec une séquence nucléotidique identique, appelée B9-scFv. Pour localiser l’épitope de B9-scFv, les sous-unités SARS-CoV-2 S, le domaine de liaison au récepteur S1, S2 et S1 (RBD) ont été purifiés à l’aide d’une analyse IMAC (chromatographie d’affinité sur métal immobilisé). La spectrométrie de masse différentielle d’échange hydrogène-deutérium (MS) a été réalisée pour évaluer le mécanisme de liaison des anticorps.
Résultats
Un épitope CDRH3 scFv (B9-scFv) largement réactif et ultralong a été isolé à partir d’une bibliothèque de chaînes lourdes naïve du SARS-CoV-2 qui a montré une liaison au SARS-CoV-2 RBD, toutes les variantes du SARS-CoV-2 préoccupantes ( COV) et SARS-CoV RBD. L’épitope a neutralisé les virus pseudotypés S du SRAS-CoV, mais pas en entrant en compétition avec la liaison au récepteur ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine 2).
Au contraire, l’épitope a neutralisé les LV pseudotypés du SRAS-CoV, disponibles de manière transitoire via les mouvements de la protéine S interdomaine et déstabilisant le complexe de préfusion. L’épitope s’est localisé dans une fente cryptique sur la surface interne du RBD, un site qui chevauchait les empreintes de quelques larges anticorps anti-SARS-CoV-2 tels que S2H97, 7D6/6D6 et FD20.
Le CDRH3 largement actif a été isolé d’une bibliothèque de diversité de séquences modeste, soulignant l’énorme potentiel du système bovin en tant que source pour obtenir des Abs largement actifs qui peuvent conférer une protection contre de nouveaux organismes pathogènes et leurs variants mutants. B9-scFv comprenait 53 % des scFv obtenus à partir de cellules 293T transduites par le LV après une seule sélection de liaison à la protéine S, qui s’élevait à 83 % lors d’un enrichissement supplémentaire en FC. Les résultats ont indiqué que B9-scFv représentait en grande partie l’activité anti-S dans la bibliothèque.
Les cellules qui ont exprimé de manière transitoire B9-scFv ont montré une liaison à S, RBD et S1, mais pas à S2, indiquant que le site de liaison B9-scFv était localisé au résidu d’acide aminé RBD 319 au résidu 591. La liaison de B9-scFv à la protéine S -les cellules transfectées étaient dépendantes de la concentration et enrichies par rapport aux témoins scFv ultralongs.
Il convient de noter que B9-scFv n’a montré aucune réactivité avec des cellules non transfectées, même à des concentrations de cinq mM pendant une heure, ce qui indique fortement une interaction S-Ab spécifique. La liaison B9-scFv-S a été maintenue à travers des mutations telles que N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N et L452R dans les COV du SRAS-CoV-2 tels que Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron et Gamma. Les résultats ont indiqué une large réactivité croisée B9-scFv.
L’affinité de liaison aux RBD variants du SRAS-CoV-2 par rapport au type sauvage (wt) S était comparable, renforçant l’observation de la liaison de B9-scFv à un épitope hautement ciblé et conservé. Le CR3022-scFv et le B9-scFv humains ciblés par le SRAS étaient relativement non réactifs avec le RBD du syndrome respiratoire du Moyen-Orient CoV (MERS-CoV), ce qui indique que le B9-scFv était spécifique au SRAS-CoV.
Seule une différence mineure a été observée pour la liaison de B9-scFv à 200 nM et 2,0 μM de SARS-CoV RBD, indiquant une affinité de liaison nanomolaire. Le B9-scFv a presque complètement (98 %) neutralisé les particules LV pseudotypées du SRAS-CoV S (souche Urbani) à une concentration de 70 μg/ml, mais n’a pas montré de tels effets pour des titres équivalents de SARS-CoV-2. La concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) la valeur pour la neutralisation du LV pseudo-typée par le SARS-CoV par B9-scFv était de 468 nM.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont mis en évidence le potentiel de in vitro-Ac bovins exprimés avec des CDRH3 ultralongs pour isoler de nouveaux agents thérapeutiques largement actifs pour lutter contre les organismes pathogènes émergents et leurs variants et pour identifier les principaux épitopes pour le développement de vaccins. L’équipe a étayé les découvertes précédemment rapportées selon lesquelles les régions CDRH3 ultralongues s’apparient avec des chaînes légères Vλ relativement invariables pour générer une matrice scFv sur laquelle des bibliothèques de chaînes lourdes ultralongues peuvent être clonées et exprimées.
