Alors que le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) continue de se propager dans le monde et de provoquer des maladies et des décès à une échelle dévastatrice, le séquençage génomique est devenu une méthode principale pour suivre les variantes émergentes et les nouvelles épidémies. Un nouveau medRxiv* preprint explore le rôle du séquençage des nanopores dans cet effort.
Sommaire
Arrière-plan
La technologie de séquençage Nanopore permet un séquençage en profondeur, étant mobile, abordable et évolutif. De plus, il ne nécessite pas d’investissements lourds dans des dispositifs ou des réseaux informatiques. De plus, il peut être utilisé pour séquencer l’un ou l’autre type de matériel génétique, soit l’acide ribonucléique, soit l’acide désoxyribonucléique (ARN ou ADN, respectivement).
Elle se prête donc au séquençage de réseaux mis en place à l’échelle mondiale. Cela pourrait permettre d’identifier précocement et de suivre plus précisément les variantes préoccupantes (COV), en utilisant les installations disponibles dans les petits laboratoires au point de service.
Ces variantes sont problématiques précisément parce qu’elles se propagent plus rapidement, sont plus infectantes ou échappent à la réponse immunitaire, et pour l’une ou l’ensemble de ces raisons, elles sont moins susceptibles d’être contenues par les mêmes stratégies en vigueur. Leur identification précoce est donc un problème urgent.
Même en dehors de cela, la recherche de l’origine du virus est en cours, et les données génomiques seront également d’une grande utilité dans cette quête.
Comment s’est déroulée l’étude ?
Le séquençage des nanopores était donc au centre de la présente étude, visant à le mettre en place avec des systèmes de diagnostic d’usage courant. Après l’avoir modifié pour plus de rapidité et de simplicité, les chercheurs l’ont testé sur des échantillons contenant le SARS-CoV-2 collectés régulièrement. Ils ont également identifié des facteurs qui agissent avant l’analyse pour influencer le succès du séquençage.
Purification d’ARN et PCR
Les chercheurs ont utilisé un protocole de purification d’ARN à base de billes magnétiques à partir d’échantillons de diagnostic résiduels. Ils ont constaté que ce protocole, utilisant un échantillonnage direct à partir d’échantillons résiduels, était non seulement efficace en termes d’échantillonnage, mais permettait également d’omettre certaines étapes, simplifiant ainsi le flux de travail.
Ils ont également déterminé que la RT-PCR semi-quantitative ou quantitative pouvait être utilisée, avec les pools d’amorces multiplex 1 et 2, afin d’effectuer la transcription inverse de l’ARN du SARS-CoV-2 (+) ainsi que d’amplifier des amplicons de 1 200 pb.
L’ensemble d’amorces divisées de minuit du protocole ARTIC a été utilisé pour la première fois dans deux cycles de PCR multiplex pour amplifier l’ADNc du SARS-CoV-2. Ici, chaque réaction de PCR donne lieu à des amplicons de 1 200 pb qui sont dans un ordre consécutif, fournissant un ensemble de séquences en mosaïque sans chevauchement. Les deux mélanges d’amplicons complémentaires sont ensuite combinés pour permettre le séquençage de l’ensemble du génome du SARS-CoV-2.
Cela a montré que l’intensité de la bande dépendait fortement des charges virales, mais variait également avec les seuils de cycle entre les deux pools. Cette approche, appelée approche « d’amorce de minuit », a réussi à amorcer le processus de transcription inverse.
Préparation et séquençage de la bibliothèque
En utilisant le kit de codage à barres rapide (SQK-RBK004, Oxford Nanopore) pour la préparation de la bibliothèque, les chercheurs ont découvert qu’ils pouvaient séquencer les produits PCR immédiatement, sans purification préalable. À l’aide de deux appareils distincts, ils ont découvert qu’une profondeur de lecture appropriée d’environ 10 Mbp par code-barres pouvait être atteinte à différents moments, en fonction de la charge virale.
En outre, ils ont séquencé l’ensemble du génome sur un appareil MinION Mk1C (Oxford Nanopore) à l’aide des pools multiplexés 1 et 2, obtenant une couverture complète et profonde (c’est-à-dire au moins 10 mégabases pour chaque code-barres). Tous les amplicons de 1200 pb ont donc été amplifiés efficacement et spécifiquement par cette réaction de PCR multiplexée.
Fusion de séquences consensus
Ils ont utilisé un processus de fusion pour résoudre les régions non résolues dans deux séquences renvoyées par deux algorithmes différents. Cette séquence « super-consensuelle » avait non seulement beaucoup moins de régions non résolues, mais a également montré des mutations de haute qualité, tout en éliminant les faux positifs pour la plupart.
Le programme de fusion de consensus est donc utile pour obtenir des appels de haute qualité entre variantes, mais souligne que les séquences dérivées des deux algorithmes différents utilisés ici sont complémentaires dans le séquençage des nanopores. L’inconvénient est la perte d’informations sur le nombre de lectures par variante et ces métadonnées.
Une seule séquence complète de haute qualité a été obtenue avec un titre SARS-CoV-2 de 4x 106 ou plus. Cela soutient la théorie selon laquelle un nombre de copies inférieur à 4x 106 indique des génomes incomplets. Autrement dit, « nous fournissons ici une preuve convaincante que les valeurs CT normalisées en nombre de copies de la RT-qPCR diagnostique peuvent être utilisées comme critère de succès du séquençage. «
Au-dessus de ce seuil, les spécimens pourraient être à juste titre attribués à différents clades.
Quelles sont les implications ?
Les chercheurs ont donc pu peaufiner leur pipeline de laboratoire, de sorte que l’ARN purifié puisse être utilisé directement à partir d’échantillons résiduels, en utilisant des valeurs de seuil de cycle comme critère principal pour la sélection des échantillons ; à la fois des réactions d’ADNc et de PCR multiplex répétées ont été effectuées en utilisant des pools d’amorces divisées à minuit. L’utilisation du dispositif Oxford Nanopore MinION Mk1C a assuré l’appel de base Guppy à bord, réduisant à la fois le temps consommé et le nombre d’étapes.
Ce protocole est donc adapté à une mise en œuvre dans des laboratoires plus petits rattachés aux hôpitaux, de manière rentable, permettant une simplification et une décentralisation du processus de séquençage. « Après le diagnostic qRT-PCR, la préparation de la bibliothèque multiplex, les contrôles de qualité, le séquençage des nanopores et le pipeline bioinformatique peuvent être entièrement effectués en un jour ouvrable. «
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
