Dans une étude récente publiée dans Nature Recherche cardiovasculaireun groupe de chercheurs a évalué l’efficacité de l’administration de Plakophilin 2 (PKP2) médiée par le virus adéno-associé (AAV) dans le traitement de la cardiomyopathie arythmogène (ACM).
Arrière-plan
La MCA est une maladie cardiaque génétique, répandue chez 1 personne sur 2 000 à 1 personne sur 5 000, souvent diagnostiquée tardivement en raison de sa nature complexe et variable. Les premiers symptômes sont subtils, mais la maladie peut évoluer vers de graves arythmies ventriculaires et une insuffisance cardiaque, nécessitant parfois une transplantation cardiaque.
Environ la moitié des cas de MCA sont liés à des mutations de gènes desmosomaux comme PKP2, qui jouent un rôle crucial dans la connectivité des cellules du muscle cardiaque. Les mutations de PKP2, en particulier dans leurs formes tronquées, perturbent l’intégrité desmosomale, entraînant un dysfonctionnement du muscle cardiaque et une progression de l’ACM.
Malgré les progrès réalisés dans la compréhension des bases moléculaires de l’ACM, les traitements efficaces font défaut, les options actuelles se concentrant sur la gestion des symptômes. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer des thérapies efficaces contre la MCA et pour explorer tout le potentiel de la restauration de la PKP2 pour inverser la progression de la maladie et améliorer la fonction cardiaque.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, des lignées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPS) portant des mutations PKP2 c.2013delC et PKP2 c.1849C>TiPS, provenant de l’Université de Californie à San Diego et du Stanford Cardiovascular Institute, ont été cultivées.
Ces cellules ont été cultivées sur des puits recouverts de Geltrex, régulièrement alimentées avec le milieu Essential 8 et passées après avoir atteint une confluence de 80 à 100 % à l’aide de l’enzyme TrypLE Express. Pour la différenciation des cardiomyocytes (CM), les cellules, à une confluence de 80 à 90 %, ont été traitées avec du milieu RPMI-1640 contenant de l’albumine humaine recombinante, du CHIR99021 et du 2-phosphate d’acide L-ascorbique, suivi d’une addition d’IWP2 au jour 2.
À partir du jour 4, le milieu a été systématiquement complété avec de l’albumine et du 2-phosphate d’acide L-ascorbique, et après le jour 8, maintenu au Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 avec un supplément B-27.
Pour évaluer la pureté des CM, 1 million de CM dérivés de cellules iPS âgées de 15 jours ont subi une série d’étapes de centrifugation et de lavage, suivies d’une fixation dans l’éthanol et d’une perméabilisation. Ils ont ensuite été colorés avec un anticorps anti-troponine T cardiaque et un anticorps anti-lapin Alexa 488 analysés par tri cellulaire activé par fluorescence.
Des expériences de patch clamp automatisées sur ces CM ont été menées à l’aide du dispositif SyncroPatch 384. Le protocole comprenait l’utilisation d’un protocole d’étapes de tension et de solutions de pipettes et de bains spécifiques pour l’enregistrement des courants de sodium. Le myocarde humain modifié (EHM) a été généré en mélangeant des CM dérivés de cellules iPS avec des fibroblastes de prépuce humain dans une matrice de collagène, en les coulant dans des puits et en les incubant. Le milieu a été initialement complété avec du facteur de croissance transformant bêta 1 (TGFβ1), suivi d’un milieu EHM ordinaire.
La contraction de l’EHM a été analysée à l’aide d’enregistrements vidéo-optiques, mesurant des paramètres tels que l’amplitude de contraction, la vitesse et les temps de relaxation. Une réaction en chaîne par polymérase (PCR) quantitative en temps réel a été réalisée sur des CM dérivés de cellules iPS pour étudier l’expression des gènes. Les souris utilisées dans l’étude ont été maintenues sur un fond C57B/6J, avec des expérimentations animales approuvées par les organismes de réglementation compétents. Une analyse échocardiographique a été réalisée sous anesthésie, mesurant divers paramètres cardiaques.
Pour l’histologie et l’immunohistochimie, les tissus cardiaques ont été fixés, intégrés et sectionnés. Des coupes de tissus ont été soumises à la récupération, au blocage et à l’incubation de l’antigène avec des anticorps primaires et secondaires, suivis d’une imagerie. L’analyse par Western blot a été réalisée sur des extraits de protéines provenant à la fois de CM dérivés de cellules iPS et de tissus ventriculaires de souris, en utilisant des anticorps spécifiques pour la détection.
Des vecteurs AAV codant pour la PKP2 humaine et murine ou des vecteurs vides ont été utilisés pour des études in vitro et in vivo. Pour les études in vitro, les CM dérivés de cellules hiPS ont été infectés par AAV6, tandis qu’in vivo, AAV9-ctr et AAV9 – PKP2 ont été injectés à des souris, soit par voie intrapéritonéale chez les ratons, soit par voie intraveineuse chez les adultes. L’analyse statistique impliquait des tests t de Student, une analyse de variance (ANOVA) et des tests post-hoc, le cas échéant, à l’aide du logiciel GraphPad Prism.
Résultats de l’étude
La présente recherche a été motivée par les données du registre néerlandais de l’ACM, qui indiquent qu’une partie substantielle des patients atteints d’ACM possèdent des variantes pathogènes de PKP2. Pour étudier les effets de la restauration de PKP2, les chercheurs ont utilisé une lignée cellulaire iPS dérivée d’un patient présentant une mutation PKP2. En utilisant un vecteur AAV, ils ont réussi à restaurer les niveaux de protéine PKP2 dans ces cellules. Cette intervention a non seulement amélioré les niveaux de PKP2, mais a également influencé positivement d’autres protéines desmosomales essentielles à l’adhésion cellule-cellule dans le cœur.
L’étude a en outre exploré les effets de la restauration de PKP2 sur les propriétés électriques des CM, en se concentrant particulièrement sur la conduction du sodium. Cet aspect est essentiel puisque les irrégularités des canaux ioniques contribuent à la nature arythmique de l’ACM. Les chercheurs ont découvert que la restauration de PKP2 dans les CM mutants normalisait la conduction du sodium, abordant potentiellement la caractéristique du substrat arythmique de l’ACM.
S’appuyant sur ces découvertes cellulaires, la recherche s’est étendue à l’EHM tridimensionnel composé d’un mélange de CM dérivés de cellules iPS et de fibroblastes de prépuce humain. Ce modèle a permis un examen plus approfondi du rôle de PKP2 dans le tissu cardiaque. Les EHM mutants présentaient une fonction contractile altérée, une caractéristique de l’ACM. Cependant, lors de la restauration de la PKP2 dans ces tissus, il y a eu une amélioration notable de la contractilité et un rétablissement de jonctions intercellulaires plus organisées.
Pour traduire ces résultats en un scénario plus cliniquement pertinent, l’équipe a utilisé un modèle murin d’ACM avec une mutation PKP2 équivalente à l’humain. Ils ont administré à ces souris un vecteur AAV portant le gène PKP2 de type sauvage. Le traitement a réussi à restaurer les niveaux de PKP2 dans le tissu cardiaque et a conduit à une reconstitution des protéines des jonctions desmosomales et adhérentes. Ces changements au niveau moléculaire se sont traduits par une amélioration de la fonction cardiaque chez les souris.
Dans une étude cruciale à long terme, les chercheurs ont administré la PKP2 à des souris mutantes et sauvages, observant les résultats sur une période de 12 mois. Cette administration à long terme de PKP2 a entraîné une récupération significative de la fonction cardiaque chez des souris mutantes sans induire d’effets indésirables chez les souris de type sauvage ou dans d’autres organes. Les souris ont présenté des fonctions cardiaques électriques et mécaniques améliorées, ce qui suggère que la restauration de PKP2 pourrait effectivement inverser certains des aspects clés de l’ACM.
