Une grande partie de la recherche sur la thérapeutique de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) s’est concentrée sur des structures essentielles telles que la protéine de pointe codée par le virus, les principales protéases, ainsi que les protéines de l’acide ribonucléique (ARN) polymérase. L’obtention d’analyses à haute résolution de ces structures fournit un aperçu mécanique de leur fonction et aide à utiliser ces structures comme cibles dans le développement de vaccins et de thérapies antivirales.
Une meilleure compréhension de ces structures permettra également aux scientifiques de surmonter efficacement les défis présentés par les variantes émergentes et l’augmentation conséquente des taux d’infection qui s’ensuit. À cette fin, une étude récente publiée dans Nature Biologie structurale et moléculaire discute des structures du SARS-CoV-2 ORF3a à l’aide de la microscopie cryoélectronique (cryo-EM).
Étude: Structure cryo-EM du SARS-CoV-2 ORF3a dans des nanodisques lipidiques. Crédit d’image : Design_Cells/Shutterstock.com
ORF3a
Le cadre de lecture ouvert codé viralement 3a (ORF3a ou 3a) est hautement conservé dans le Bêtacoronavirus sous-genre Sarbecovirus, qui comprend le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS), qui est le virus responsable de l’épidémie de 2002, et d’autres coronavirus liés aux chauves-souris. En étudiant le rôle de 3a dans ces et futurs coronavirus, les scientifiques peuvent mieux comprendre comment cibler et contrôler ces virus lorsqu’ils émergent lors de futures épidémies.
Des études antérieures ont observé l’effet du SRAS et du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) chez des patients utilisant des biopsies et d’autres tests. Dans ces études, l’expression de 3a a été identifiée dans les tissus infectés des patients atteints du SRAS, tandis que des anticorps anti-3a ont été trouvés dans le plasma des patients atteints du SRAS-CoV-2.
Il est important de noter que le SRAS 3a est associé à l’activation de l’inflammasome ainsi qu’à la mort cellulaire apoptotique et nécrotique. Comparativement, le SARS-CoV-2 3a a été impliqué dans l’apoptose et l’inhibition de l’autophagie in vitro. La délétion génomique de 3a dans les modèles murins du SRAS et du SRAS-CoV-2 s’est avérée réduire à la fois le volume du virus et la morbidité chez la souris.
3a est connue comme l’une des trois viroporines codées par le génome du SRAS-CoV-2, avec la protéine d’enveloppe E et ORF8a. Les viroporines sont de petites protéines virales multifonctionnelles essentiellement hydrophobes qui peuvent altérer les membranes cellulaires. Cette altération des cellules hôtes peut conduire à la libération de virus à partir de cellules infectées, augmentant encore la propagation du virus.
3a a été suggéré pour former un canal ionique, le 3a du SRAS étant signalé comme formant un émodine et du baryum (Ba2+)- canaux cationiques sensibles. Malgré ces résultats, le rôle spécifique de 3a dans la pathogenèse des maladies reste inconnu, ce qui peut être dû au manque de compréhension du fonctionnement de 3a.
Pour résoudre ce problème, les chercheurs du présent article ont utilisé la microscopie cryoélectronique (cryo-EM) pour déterminer les structures du SARS-CoV-2 3a. Cet article visait à évaluer l’activité de 3a en tant que canal ionique in vitro en utilisant l’électrophysiologie et les analyses de flux d’ions fluorescents.
Résultats de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont déterminé les structures du SARS-CoV-2 3a dimère et tétramère dans les nanodisques lipidiques. Les nanodisques ont été fabriqués à partir de la protéine d’échafaudage MSP1E3D1 et d’un mélange de lipides DOPE, POPC et POPS. Les structures de ces nanodisques ont ensuite été analysées par cryo-EM à une résolution de 2,9 et 6,5 Å.
SARS-CoV-2 3a s’est avéré adopter un nouveau pli dimérique, formant un calcium non sélectif (Ca2+) canal cationique perméable. Vu du plan membranaire, 3a peut être perçu comme ayant une hauteur d’environ 70 Â avec une région transmembranaire élevée de 40 Â et un domaine cytosolique qui s’étend à 30 Â hors de la membrane.
La région transmembranaire de 3a se compose de trois hélices par protomère avec l’extrémité N positionnée du côté extracellulaire et l’extrémité C du côté cytosolique. Les hélices transmembranaires (TM) peuvent également être vues pour tracer la circonférence d’une ellipse du côté extracellulaire. Les TM sont structurés les uns contre les autres et sont reliés par de courts linkers intracellulaires et extracellulaires.
une, Carte cryo-EM du dimère 3a dans les nanodisques MSP1E3D1 à une résolution nominale de 2,1 Å, vue depuis le plan de la membrane. Une sous-unité est colorée en gris et la deuxième sous-unité est colorée avec la région transmembranaire en orange et le CD en rose. La densité du nanodisque MSP1E3D1 est de couleur beige et le lipide DOPE est de corail. b,c, Modèle du dimère 3a vu de la membrane (b) (un péché une) et du côté extracellulaire ou luminal (c). ré, Vue agrandie de l’interaction entre les sous-unités de la CD avec les résidus formant le noyau hydrophobe indiqué. e, Schéma d’un monomère 3a. Les éléments de structure secondaires sont indiqués, et les extrémités non modélisées et une boucle β3-β4 à cinq acides aminés sont représentées par des lignes pointillées. F, Cryo-EM densité et modèle pour un brin sélectionné du CD à deux seuils différents. g, Vue agrandie de la densité dans la région d’interaction MSP1E3D1. h, Modèle dans la même région que g avec des résidus clés dans la zone affichés sous forme de bâtons.
Dans le SRAS-CoV-2 3a, les agents réducteurs et une mutation C133A se sont avérés entraîner une perte d’oligomérisation, de localisation membranaire et d’activité des canaux ioniques. Cependant, avec la faible expression de la mutation C133A, ces résultats peuvent être dus à une déstabilisation des protéines.
En étudiant si les bloqueurs d’inhibition de cations non sélectifs inhibent l’activité 3a dans les liposomes, les chercheurs ont observé que le rouge de ruthénium, un colorant polycationique 786-Da, bloque l’activité 3a dans les enregistrements actuels et Ca2+ afflux. Cependant, d’autres tests sur les bloqueurs de faible affinité de l’activité du canal 3a du SRAS, tels que Ba2+ et l’émodine, n’ont pas inhibé l’activité du SARS-CoV-2 3a. Cette découverte a été confirmée par une observation cryo-EM, où les chercheurs n’ont pas noté l’apparition de liaison à l’émodine.
Conclusion
Ces résultats constituent la base de recherches ultérieures sur les mécanismes de la synchronisation et de la conduction du canal 3a. L’étude mentionne que si 3a exerce une activité de canal dans les cellules, cette viroporine pourrait jouer un rôle important dans la promotion de la maturation virale par l’inhibition de l’autophagie et la perturbation des lysosomes. Puisqu’il a été démontré que le 3a du SRAS-CoV-2 stimule la mort cellulaire programmée dans les cellules en culture, combiné à l’observation que l’afflux de calcium par le 3a pourrait être un déclencheur d’activation pour les caspases dépendantes du calcium et l’apoptose, le rôle de la perméabilité au calcium dans 3a pourrait être une cible thérapeutique importante.
Les chercheurs ont également décrit la possibilité que l’expression d’un canal perméable au calcium puisse affecter l’homéostasie pulmonaire et, à son tour, la pathogenèse de l’infection par le SRAS-CoV-2. Cela fournit des preuves supplémentaires soutenant l’utilisation de 3a comme cible pour le traitement du SRAS-CoV-2, ainsi que d’autres coronavirus liés aux chauves-souris, en raison du rôle de 3a dans le cycle de vie viral.
