Une pré-impression provocante parue récemment sur le bioRxiv * Le serveur indique que le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) nécessite du cholestérol pour entrer dans les cellules hôtes et la fusion membranaire. Cela pourrait avoir des implications importantes pour les stratégies thérapeutiques de lutte contre la pandémie actuelle de coronavirus 2019 (COVID-19).
Le virus se fixe aux cellules hôtes via les glycoprotéines de pointe trimères qui tapissent son enveloppe lipidique. Le pic s’attache au récepteur de la cellule hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2), via son domaine de liaison au récepteur (RBD). La liaison du pic au récepteur provoque un changement conformationnel du pic viral qui déclenche la fusion membranaire entre le virus et la membrane cellulaire.
Cette fusion médie la formation d’une cellule multinucléée ou syncytiale. Cet événement de fusion est important dans de nombreuses infections telles que le virus respiratoire syncytial (RSV) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), mais leur rôle dans l’infection par le SRAS-CoV-2 n’est pas clair.
Les syncytia dérivent d’événements de fusion au niveau de grappes de protéines spike-ACE2 de type synapse. Crédit d’image: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.14.422737v1.full.pdf
Sommaire
La fusion par étapes des cellules virus-hôtes
L’étude actuelle se concentre sur les mécanismes sous-jacents à la formation syncytiale, en utilisant une approche microscopique. Les chercheurs ont utilisé des cellules d’ostéosarcome humain exprimant soit ACE2, soit un pic / RBD complet. Une étiquette fluorescente a été ajoutée pour permettre une détection facile.
Concernant le mécanisme de formation des syncyties, ils ont émis l’hypothèse que les syncyties pourraient se former étape par étape. En confirmation, ils ont constaté que lorsque les cellules exprimant ACE2 et RBD étaient cultivées ensemble, des complexes ACE2-RBD étaient trouvés aux points de contact cellulaire.
D’autre part, lorsque ACE2 et des types de cellules exprimant les pics ont été co-cultivés, ils ont presque immédiatement observé l’accumulation de dizaines de complexes de protéines de pointe ACE2-pleine longueur, près des points de contact intercellulaire. Celles-ci ont été formées par l’accumulation de protéines de pointe à proximité de foyers membranaires saillants contenant de l’ACE2. Ces structures ont persisté pendant plusieurs minutes, semblables aux synapses formées entre les cellules nerveuses ou immunitaires.
Cette fusion ponctuelle initiale en plusieurs points a conduit à la formation éventuelle de pores de fusion cellulaire. L’amas de pointes à chaque point a été dessiné vers le centre de la cellule exprimant ACE2 en quelques minutes ou plus. Des pores de fusion dilatés ont été observés, indiquant que les actions du cytosquelette peuvent agir conjointement avec l’endocytose, ou indépendamment, pour stabiliser le mélange des deux bicouches lipidiques, des membranes cellulaires virales et hôtes.
Vacuolisation cytopathique
Sur des cultures de cellules densément plaquées, ces événements sont terminés en une heure et de petites syncyties se rejoignent pour former des syncyties plus grandes en une journée, pour la plupart des cellules. Des vacuoles se forment dans le syncytial avec le temps, probablement après l’effondrement des organites cellulaires après la fusion. En 72 heures ou moins, les cellules se décomposent par autophagie, laissant des vésicules stationnaires recouvertes d’un pic ou de la protéine ACE2.
La formation de syncytia suivie de la vacuolisation des cellules infectées peut expliquer les lésions pulmonaires généralisées observées chez les patients atteints de COVID-19 gravement malades.
Curieusement, le pic de SARS-CoV-2 est un médiateur particulièrement puissant de la formation de syncytia par rapport à la fois au pic de SARS-CoV-1 et aux fusogènes couramment étudiés.. »
En effet, ils ont trouvé une incidence très élevée de syncytie chez les patients décédés des lésions alvéolaires diffuses (DAD) induites par le COVID-19, mais pas chez les patients testés positifs pour le virus mais n’ayant pas montré d’atteinte pulmonaire, ni chez les patients décédés. de DAD avant le début de la pandémie.
Cependant, la protéine de nucléocapside virale (N) n’a pas été détectée dans le syncytia. « Nous ne pouvons pas exclure une anomalie pulmonaire encore à identifier spécifique à l’infection par le SRAS-CoV-2. »
Proxy pour l’entrée virale et la fusion cellulaire
Ce système cellulaire est une représentation fidèle des événements de liaison post-récepteur. Lorsque les cellules exprimant les pics interagissent avec les cellules Vero E6 et d’autres cellules qui supportent l’infection par le SRAS-CoV-2, une fusion cellulaire se produit.
Les mêmes domaines étaient impliqués à la fois dans les entrées virales dans la cellule hôte et pour la fusion cellule-cellule. Les deux nécessitaient la présence du site de clivage S2 ‘, mais l’interface S1 / S2 n’était pas nécessaire. Et enfin, ils ont découvert que plusieurs fluorophores différents pouvaient être utilisés pour marquer cet événement.
En conséquence, ils ont pu utiliser ce système de co-culture au lieu du SRAS-CoV-2 vivant beaucoup plus dangereux, en se dispensant des précautions de biosécurité de niveau 3.
Dépistage des thérapies potentielles
Pour le confirmer, les chercheurs ont réalisé un criblage à haut débit de composés qui modulent la fusion entre les cellules, y compris plus de 6000 produits chimiques et 30 variantes de pic. Ils ont construit et testé trois méthodes différentes, deux utilisant des marqueurs mCherry et GFP sur le pic et des cellules exprimant ACE2, pour indiquer une fusion des cellules portant chaque marqueur par co-localisation nucléaire de mCherry / GFP. Le troisième utilise la split-GFP qui nécessite que ses deux moitiés se réunissent, comme après la fusion cellulaire, pour produire une fluorescence.
Les résultats ont montré que parmi les inhibiteurs de protéase, seul le nelfinavir était capable de bloquer la fusion, peut-être parce qu’il cible des processus autres que la protéolyse. Aucune voie d’endocytose ne s’est révélée être une partie essentielle de la formation de syncytia. Cependant, certains médicaments spécifiques ont montré la capacité de supprimer cet événement, y compris un qui a empêché la polymérisation de l’actine.
Plusieurs médicaments efficaces ont été impliqués dans la perturbation des lipides membranaires, notamment les statines, les dicholorophénéthyl-imidazoles et les lactones macrocycliques contenant du tétrahydropyrane. Surtout, ceux-ci peuvent tous avoir des effets directs sur la membrane plasmique.
D’autres travaux ont montré que la partie proximale de la protéine spile, à savoir le domaine transmembranaire, a probablement un rôle essentiel dans la formation des synapses avec les cellules portant ACE2.
Les chercheurs ont également découvert que l’ajout post-traductionnel de résidus palmitoyle aux cystéines dans le domaine cytoplasmique de la protéine de pointe est également important pour la fusion. Les protéines membranaires palmitoylées sont préférées par le cholestérol pour la formation de radeaux lipidiques ou de nanodomaines membranaires riches en lipides
Quelles sont les conclusions et les implications?
Les observations suggèrent que la protéine de pointe interagissait avec les lipides membranaires plutôt qu’avec les protéines membranaires. Cependant, il ne s’est pas accumulé dans les radeaux lipidiques (domaines membranaires riches en cholestérol), une découverte inattendue étant donné l’implication conventionnelle des nanodomaines membranaires enrichis en sphingomyéline dans de telles interactions.
Au lieu de cela, le pic s’associe directement aux molécules de cholestérol en dehors de ces radeaux. Enfin, ils ont constaté que la supplémentation en cholestérol dans la région d’interaction stimule nettement la fusion.
D’après ces résultats, il semble que de nombreux médicaments qui inhibent la fusion le font en éliminant le cholestérol de la membrane plasmique. Comme cela implique la membrane plasmique du virus, contenant la protéine de pointe, bien que dérivée de la cellule hôte, ces médicaments ne devraient pas être utiles pour empêcher l’entrée virale. Cependant, les médicaments ciblant les lipides pourraient empêcher la formation de particules virales susceptibles de produire une fusion.
Un médicament prometteur, Apilimod, a pu empêcher une telle entrée à des concentrations nanomolaires car il inhibe la lipide kinase PIKFYVE. Un autre composé, MBCD, qui élimine directement le cholestérol de la membrane plasmique, a également empêché l’entrée virale par fusion directe, dans une expérience antérieure impliquant des pseudovirus porteurs de pics et des cellules exprimant ACE2 / TMPRSS2.
Dans une autre expérience, le traitement des cellules avec MBCD avant l’exposition au SRAS-CoV-2 n’a pas réussi à prévenir l’infection, bien que la syncytie ne se soit pas formée. Cependant, lorsque le virus était exposé à cet agent, l’infection était complètement inhibée. « Par conséquent, la teneur en cholestérol des particules virales du SRAS-CoV-2, mais pas de la cellule hôte, est essentielle à l’infectivité. »
Une autre observation intéressante était que les 4 principales protéines transmembranaires humaines à haute teneur en cystéine et aromatique dans les domaines membranaires proximaux, similaires à la protéine de pointe SARS-CoV-2, étaient au cœur de la formation de jonctions serrées entre les cellules. Ainsi, le même type de mécanisme peut sous-tendre l’adhésion et le contact cellule-cellule entre le SARS-CoV-2 et les cellules hôtes.
Nos résultats suggèrent que la modulation de la composition de la membrane peut inhiber la propagation virale et informe en outre les assemblages lipides-protéines critiques dans la syncytie physiologique et l’adhésion cellulaire.. »
En fait, des études rétrospectives antérieures ont montré que les patients COVID-19 sous statines hypocholestérolémiants ont des taux de mortalité significativement plus bas. Cela pourrait également expliquer plusieurs autres facteurs de risque de COVID-19 comme l’obésité, l’âge avancé et la ménopause, qui sont liés à un métabolisme lipidique anormal.
« Des travaux supplémentaires sont clairement nécessaires, mais dans le contexte de l’évolution rapide du paysage des options de traitement COVID-19, nos résultats soulignent l’utilité potentielle des statines et d’autres traitements modifiant les lipides.. »
