Dans une étude récente publiée dans Stem Cell Reports, des chercheurs ont évalué l’utilisation d’un système CRISPR-Cas3 à double répétition palindromique courte et régulièrement espacée pour induire le saut multi-exon (MES) chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). cellules souches pluripotentes (CSPi).
Étude: Système double CRISPR-Cas3 pour induire le saut multi-exon dans les iPSC dérivées de patients DMD. Crédit d’image : vchal/Shutterstock.com
Sommaire
Arrière-plan
La DMD est un trouble grave de dégénérescence musculaire provoqué par des mutations génomiques provoquant un déplacement du gène de la dystrophine. Le saut d’exon est une approche prometteuse pour restaurer la protéine dystrophine, le système CRISPR-Cas9 apparaissant comme une approche émergente.
Cependant, il existe des techniques limitées pour induire une suppression importante afin de couvrir des exons cibles répartis sur des centaines de kilobases.
À propos de l’étude
La présente étude a évalué le système CRISPR-Cas3 en tant qu’outil d’édition du génome pour les patients atteints de DMD.
Un système rapporteur basé sur le recuit simple brin (SSA) bicolore a été développé pour Cas3 afin d’améliorer les cellules génétiquement modifiées, suivi d’une analyse à distance.
Le multiplexage des ARN Cas3-CRISPR (ARNcr) a provoqué un MES génomique. Les meilleurs appariements d’ARNcr pour induire le MES dans les cellules souches pluripotentes induites par la DMD ont été étudiés et une méthode rapporteur pour enrichir les cellules éditées par le génome a été conçue.
Pour étudier la possibilité de mutagenèse hors cible, un séquençage du génome entier (WGS) des clones génétiquement modifiés a été réalisé, suivi d’une enquête sur les délétions liées aux régions potentielles de liaison de l’ARN CRISPR.
Une paire d’ARNr prenant en sandwich la région génomique cible a été utilisée pour l’analyse. L’approche dual Cas3 a été enrichie à l’aide du système de vecteur rapporteur SSA adapté au dual Cas3.
L’équipe a également testé les modèles de délétion induits par le dual-Cas3 entrant avec l’intervalle de 344 kb dans les cellules 293T du rein embryonnaire humain (HEK). Des séquences avec de longs espaceurs (0,5 à 1,7 kb) comprenant la région de détection d’ARN CRISPR ont été insérées pour étendre la séquence génétique cible vers la suppression de Cas3.
Des rapporteurs SSA de type double pseudo ont été construits pour évaluer les activités génétiques des deux côtés des ARN CRISPR dans le système CRISPR-Cas3.
En outre, les chercheurs ont vérifié si l’utilisation de plus de deux ARN CRISPR pouvait augmenter l’efficacité de suppression de 340 Ko. Quatre ARN CRISPR ont été développés avec un intervalle de 110 kb, couvrant la zone de 340 kb, et 11 ARN CRISPR ciblés sur les 11 exons positionnés entre l’exon 45 et l’exon 55.
Des analyses d’immunocoloration et de Western blot ont été effectuées pour évaluer la récupération de la protéine dystrophine, et une PCR par transcription inverse (RT-PCR) a été utilisée pour confirmer l’induction du MES au niveau de l’acide ribonucléique messager (ARNm).
Le système d’édition du génome basé sur Dual-Cas3 et les sous-clones induits par le MES ont été étudiés afin de déterminer les combinaisons optimales pour l’induction du MES dans les iPSC DMD.
Après transfection de vecteurs d’acide désoxyribonucléique (ADN) plasmidique d’ARN Cas9/guide unique ou de vecteurs d’acide désoxyribonucléique (ADN) plasmidique Cas3/Cascade/CISPR, le nombre de copies génomiques aux points médians des paires d’ARNcr a été évalué par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (ddPCR) pour déterminer l’efficacité de la suppression.
Les produits PCR ont été soumis au séquençage Sanger. Outre le double système CRISPR-Cas3 vers l’intérieur, les chercheurs ont évalué les doubles orientations Cas3 vers l’extérieur et parallèles. Les cibles génomiques ont été amplifiées à l’aide d’amorces de réaction en chaîne par polymérase situées au-dessus de l’exon 45 et en dessous de l’exon 55.
L’édition du génome à l’aide du double système CRISPR-Cas3 a été réalisée dans les lignées de cellules souches pluripotentes induites obtenues par des patients DMD FF12020, CiRA00458 et CiRA00646.
L’équipe a vérifié si la population génétiquement modifiée pouvait être améliorée en triant les cellules à l’aide des vecteurs rapporteurs d’hybridation simple brin bicolores parmi les cellules HEK293T.
Pour distinguer les variations du nombre de copies (CNV) médiées par Cas3 des spontanées, l’équipe a évalué la distance de chaque CNV détectée des sites de liaison d’ARN CRISPR potentiels les plus proches.
Résultats
Les doubles ARNc ont induit une délétion importante au niveau de la zone 45 à 55 de l’exon de la dystrophine (340 kb) parmi les cellules HEK293T et dans les iPSC, qui pourrait être appliquée à divers types de DMD. L’induction du MES a restauré la protéine dystrophine dans les DMD-iPSC avec trois mutations distinctes.
Aucune délétion significative hors cible n’a été trouvée au niveau des sites de liaison putatifs de l’ARNcr. La méthode CRISPR-Cas3 double de type vers l’intérieur a effectivement provoqué des suppressions efficaces allant jusqu’à 344 kb parmi les cellules HEK293T et les iPSC obtenues par les patients DMD.
Les rapporteurs d’hybridation monobrin bicolores ont facilité la séparation des cellules présentant d’importantes délétions génétiques. La récupération de la protéine dystrophine ne correspondait pas aux résultats de la ddPCR. Le double système CRISPR-Cas3 pourrait induire un MES dans les iPSC DMD avec plusieurs mutations et restaurer la dystrophine, indiquant la large applicabilité de l’approche CRISPR-Cas3.
La suppression ciblée de 344 Ko induite par dual-Cas3 a été détectée comme une variation du nombre de copies (CNV) dans les clones n° 7-1 et n° 4-3. L’analyse WGS n’a démontré aucune mutation apparente hors cible liée au système double CRISPR-Cas3, indiquant la haute spécificité du système double CRISPR-Cas3.
Il n’y avait pas de différence significative dans la fréquence d’apparition du SNV/indels entre NC2 et #7-1 ou entre NC2 et #4-3.
Conclusion
Sur la base des résultats de l’étude, le double système CRISPR-Cas3 peut potentiellement induire d’importantes délétions génomiques pour induire le MES chez les patients DMD présentant des modèles mutationnels. Cependant, il présente des limites telles que la variation des modèles de suppression et l’incapacité de contrôler le début et le point final précis.
Les études futures devraient étudier les méthodes permettant d’introduire Cas3 dans les cellules afin d’améliorer l’efficacité de l’édition du génome. Des tests phénotypiques avancés seront nécessaires pour démontrer l’efficacité de l’approche MES à double médiation Cas3 dans les myotubes après la différenciation des iPSC.
Ces résultats pourraient éclairer les développeurs de stratégies pour traiter la DMD et d’autres troubles génétiques nécessitant des délétions importantes.
