Les virus exploitent les protéines de la cellule hôte pour entrer dans la cellule puis se propager, les protéines spécifiques dépendant du virus. Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2), par exemple, est connu pour interagir avec le récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) et la protéase TMPRSS2 à la surface des cellules pour adhérer et subir ensuite le clivage de la protéine de pointe pour faciliter l’entrée dans la cellule, respectivement. De même, la grippe A doit être préparée pour la liaison au récepteur et la fusion par clivage de l’hémagglutinine de surface du virus par des protéases de type trypsine.
L’identification des protéines humaines requises par plusieurs types de virus divers serait avantageuse en médecine, orientant les efforts de découverte de médicaments vers la création d’antiviraux à large spectre.
Dans un document de recherche récemment téléchargé sur le bioRxiv* serveur de préimpression par Poston et al. (8 aoûte, 2021), les facteurs hôtes communs parmi plusieurs agents pathogènes zoonotiques sont explorés par le criblage CRISPR-Cas9 dans les cellules pulmonaires humaines, en se concentrant en particulier sur le genre betacoronavirus.
Comment l’étude a-t-elle été réalisée ?
Le SARS-CoV, le MERS-CoV et le SARS-CoV-2 sont les bêta-coronavirus humains les plus répandus en termes de morbidité. Cependant, plusieurs autres coronavirus peuvent infecter l’homme : HCoV-OC43 et HCoV-HKU1 du genre betacoronavirus, et HCoV-229E et HCoV-NL63 du genre alphacoronavirus.
Le groupe de recherche a commencé par infecter des cellules pulmonaires humaines avec HCoV-OC43 et les a incubées pendant une semaine, moment auquel les cellules survivantes ont été évaluées pour les facteurs de dépendance. De multiples gènes impliqués dans la biosynthèse de l’héparane sulfate ont été identifiés, suggérant que l’héparane sulfate est impliqué dans la fixation du virus à la surface cellulaire, comme cela est connu dans la littérature. En outre, plusieurs gènes impliqués dans l’activité endosomique et le transport de matériel extracellulaire dans la cellule, y compris la protéine associée au tri des protéines vacuolaires 29 (VPS29), ont également été identifiés.
Le groupe de recherche de l’Université Rockefeller a utilisé l’édition de gènes CRISPR-Cas9 pour générer des lignées cellulaires dépourvues des gènes identifiés. Dans ces lignées cellulaires, la viabilité et la prolifération cellulaires n’ont pas été affectées, et les cellules ont ensuite été infectées par HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-229E ou un pseudovirus SARS-CoV-2, ainsi que plusieurs virus en dehors de le genre de coronavirus tel que le virus respiratoire syncytial, l’adénovirus ou le virus de la grippe A.
Un écran CRISPR révèle les gènes influençant la susceptibilité au HCoV-OC43 (A) Schéma de la configuration du dépistage (B) Résultats de l’écran, où l’axe des x correspond à chaque gène unique de la bibliothèque (étiqueté au hasard de 1 à 19 114) et l’axe des y indique le score du gène -log10 MAGeCK. Tous les gènes dont le score est supérieur au pseudogène de contrôle non ciblé le plus performant sont marqués en bleu. Le criblage a été effectué dans trois réplicats indépendants (C) analyse string-db et annotation UniProt des hits de gènes. Les couleurs des sphères correspondent aux mots-clés UniProt et les lignes de connexion indiquent la force des preuves sous-jacentes aux interactions gène-gène (rose : interaction déterminée expérimentalement ; bleu : interaction annotée dans des bases de données organisées ; gris : preuve de co-expression ; jaune : extraction de texte).
Coup de grâce VPS29
Les chercheurs ont noté que le VPS29 et le complexe régulateur endosomal associé (complexe CCC) étaient essentiels pour faciliter l’infection par le coronavirus dans toutes les lignées cellulaires testées.
Dans le même temps, les autres types de virus n’étaient pas altérés par le knock-out de VPS29. Cependant, comme chacun des virus explorés est connu pour exploiter des voies endocytaires pour entrer dans la cellule, ce résultat implique que le knock-out de VPS29 n’altère généralement pas la fonction endocytaire au sein de la cellule.
Pourtant, seule cette entrée de coronavirus est spécifiquement affectée. En effet, les cellules pulmonaires primaires épithéliales bronchiques humaines avec VPS29 inactivé présentaient une forte résistance à l’infection par HCoV-OC43.
En revanche, le knock-out de VPS29 a amélioré l’infection par le virus de la grippe A, en particulier dans deux lignées cellulaires exprimant des récepteurs de coronavirus. VPS29 peut participer à plusieurs complexes protéiques impliqués dans l’endocytose qui peuvent interagir préférentiellement avec un virus par rapport à un autre. Ainsi, pour étudier cela, le groupe a effectué un criblage d’ARNsi qui a ciblé des protéines connues pour interagir avec VPS29.
VPS29 peut appartenir au complexe rétromère, un élément clé de la machinerie de tri endosomal, composé des protéines VPS26A, VPS29, VPS35 ou RAB7A. Le knock-down de l’une de ces protéines a également altéré l’infection par les coronavirus, et donc le complexe rétromère est probablement impliqué dans l’entrée dans les cellules par les coronavirus. Inversement, l’infection par le virus de la grippe A s’est avérée augmentée en l’absence d’un complexe rétromère fonctionnel.
Le groupe a utilisé la microscopie à fluorescence pour déterminer que le knock-out de VPS29 provoquait l’agrandissement et la désacidification des endosomes, tout en présentant toujours des capacités de chargement de cargaison normales. Un pseudovirus SARS-CoV-2 étiqueté a été utilisé pour visualiser la voie d’entrée dans les cellules, notant que le virus s’accumulait dans les endosomes avant de sortir dans le cytoplasme dans les cellules non knock-out. Alors que dans les cellules knock-out VSP29, le virus s’est accumulé mais n’a pas pu s’échapper de l’endosome.
Des expériences identiques avec le virus de la grippe A n’ont révélé aucune accumulation dans les endosomes, la sortie étant améliorée. Le groupe suggère que le pH plus élevé observé dans les endosomes des cellules knock-out est probablement la cause de la sortie altérée ou améliorée dans le cytoplasme par les coronavirus ou le virus de la grippe A, respectivement.
Dans les coronavirus, plusieurs étapes de traitement biochimique doivent avoir lieu pour préparer la sortie et la prolifération, que le changement de pH peut avoir perturbé. Dans le même temps, l’environnement moins acide est simultanément moins destructeur vis-à-vis des virions de la grippe A.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
