Dans une étude récente publiée dans La natureles chercheurs ont démontré qu’une protéine du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) fonctionne comme un imitateur d’histone pour perturber la régulation épigénétique des cellules hôtes.
Des preuves récentes indiquent que l’infection par le SRAS-CoV-2 supprime les réponses immunitaires innées et perturbe la régulation épigénétique. Cependant, on ne sait toujours pas comment cela se produit. Rarement, d’autres virus virulents peuvent interférer avec la régulation épigénétique en imitant les protéines de l’hôte, en particulier les histones. Les histones enveloppent l’ADN dans des structures complexes et régulent l’accès au génome.
Les histones subissent un spectre de modifications post-traductionnelles (PTM), qui sont régulées dynamiquement pour le contrôle de l’expression génique. Le mimétisme des histones permet aux virus de perturber la capacité des cellules à répondre à l’infection et à réguler l’expression des gènes. Néanmoins, le mimétisme des histones par les coronavirus (CoV) n’a pas encore été validé.
L’étude et les conclusions
La présente étude a examiné si le SRAS-CoV-2 utilise le mimétisme des histones pour altérer la régulation de la chromatine et la réponse aux infections. Tout d’abord, les chercheurs ont effectué une comparaison bioinformatique des protéines du SRAS-CoV-2 avec des histones humaines. Il y avait une correspondance identique de six résidus entre les acides aminés 50 à 55 du cadre de lecture ouvert 8 (ORF8) et les régions critiques de l’extrémité N-terminale de l’histone H3.
Ces résidus se trouvent dans une région désordonnée à la surface de l’ORF8 monomère. Curieusement, la séquence ARKS a été trouvée dans ce motif, qui est présent dans la queue H3 à deux sites différents. La caractérisation protéomique a révélé l’ADN méthyltransférase 1 (DNMT1) comme partenaire de liaison de l’ORF8.
Ensuite, la localisation intracellulaire d’ORF8 a été étudiée pour déterminer si elle fonctionnait comme un imitateur d’histone. Les cellules HEK293T ont été transfectées avec une construction Strep-tagged codant ORF8, qui a été visualisée à l’aide d’une sonde fluorescente. L’immunofluorescence a révélé que l’ORF8 était généralement localisé dans le cytoplasme et la périphérie nucléaire.
Cependant, le fractionnement cellulaire a indiqué qu’il était situé à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme. En outre, l’équipe a découvert que l’ORF8 était colocalisé avec les lamines B1 et A/C dans les cellules transfectées. Le modèle d’expression a été confirmé dans la lignée cellulaire A549 infectée par le SRAS-CoV-2 exprimant l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2). Ensuite, la liaison à la chromatine a été évaluée en utilisant des concentrations croissantes de sel. L’ORF8 s’est dissocié de la fraction de chromatine à des concentrations de sel similaires à celles des lamines et des histones.
En revanche, la suppression du motif ARKSAP dans ORF8 (ORF8ΔARKSAP) lui a permis de se dissocier à des concentrations de sel inférieures, ce qui implique que le motif mimétique d’histone putatif influence la force de l’association entre ORF8 et la chromatine. L’immunoprécipitation de la chromatine avec séquençage (ChIP-seq) a démontré l’enrichissement de l’ORF8 dans des régions génomiques spécifiques, en particulier celles associées à la modification H3K27me3.
ORF8 s’est également avéré s’associer à la lysine acétyltransférase 2A (KAT2A). ORF8ΔARKSAP n’était pas associé aux protéines de la chromatine, ce qui suggère que le motif ARKSAP améliore l’association de l’ORF8 avec les protéines de la chromatine. Une analyse par spectrométrie de masse ciblée a été effectuée pour examiner si le site mimétique des histones est modifié de la même manière que les histones. Cela a identifié un résidu de lysine dans le site mimique proposé qui a été acétylé, similaire à l’histone H3.
En outre, l’expression de l’ORF8 a provoqué une baisse marquée de l’abondance de KAT2A, tandis que les protéines de la lamina nucléaire et les niveaux d’hétérochromatine associée à la lamina sont restés inchangés ou ont légèrement augmenté. Ensuite, l’équipe a observé que les PTM d’histone associées à la répression de la transcription étaient augmentées dans les cellules HEK293T transfectées qui exprimaient l’ORF8, tandis que celles associées à l’expression active du gène étaient épuisées. Plus précisément, ceux du motif ARKS de H3 étaient fortement perturbés.
Le dosage de la chromatine accessible à la transposase avec séquençage à haut débit a démontré que l’ORF8 réduisait l’accessibilité de la chromatine mais pas l’ORF8ΔARKSAP. Le séquençage de l’ARN a été réalisé pour définir les gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les cellules transfectées. ORF8 et ORF8ΔARKSAP partageaient un sous-ensemble de DEG, mais la présence du motif imitant l’histone a entraîné des changements moins dynamiques dans l’expression des gènes.
Gènes régulés négativement en réponse à ORF8 par rapport à ORF8ΔARKSAP avaient une plus grande accessibilité à la chromatine et des niveaux basaux plus élevés de la modification H3K9ac que les gènes régulés positivement. Ensuite, un mutant SARS-CoV-2 dépourvu d’ORF8 (SARS-CoV-2∆ORF8) a été généré ; A549ACE2 des cellules ont été infectées avec ce mutant ou SARS-CoV-2 pour comparer les niveaux génomiques viraux et la production de particules virales.
Il n’y avait aucune différence dans les titres viraux ou le nombre de copies du génome à 24 heures, et seuls des changements mineurs étaient évidents à 48 heures. L’infection par le SRAS-CoV-2 a provoqué des augmentations robustes des PTM d’histones répressives (H3K9me3 et H3K27me3). A l’inverse, cet effet était atténué en l’absence d’ORF8.
D’autres expériences avec un mutant SARS-CoV-2 où le motif ARKSAP a été supprimé de l’ORF8 (SARS-CoV-2ΔARKSAP) a révélé une atténuation substantielle des effets de l’infection sur H3K9ac et l’accessibilité de la chromatine, reproduisant les effets de ORF8 effacement. L’infection par le SRAS-CoV-2 de type sauvage a diminué l’expression de KAT2A, tandis que le SRAS-CoV-2ΔARKSAP ou SRAS-CoV-2∆ORF8 pas l’infection.
Enfin, des cellules alvéolaires pulmonaires de type II (iAT2) dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont été infectées par le SRAS-CoV-2 de type sauvage et mutant. Le nombre de copies du génome des virus mutants a été réduit 48 heures après l’infection, ce qui implique que l’ORF8, en particulier le motif ARKSAP, influence la réplication virale. Les particules virales générées par le mutant ΔORF8 étaient inférieures à celles du virus de type sauvage. En revanche, le mutant ΔARKSAP est apparu similaire au SRAS-CoV-2 de type sauvage, ce qui implique que l’ORF8 a une fonction ARKSAP-indépendante de génération de particules virales.
conclusion
L’étude a démontré que l’ORF8 du SARS-CoV-2 contient un motif ARKS et que l’expression de l’ORF8 perturbe la régulation des histones PTM. Les chercheurs ont découvert l’association de l’ORF8 avec les protéines associées à la chromatine, la lamina nucléaire et les histones. Semblable aux histones, ORF8 subit une acétylation au sein du motif mimique des histones.
La suppression d’ORF8 a provoqué une réduction de la réplication virale dans les cellules iAT2, alors que le nombre de copies du génome viral a été explicitement affecté par la perte du motif imitant l’histone. Dans l’ensemble, les chercheurs ont identifié un nouveau cas de mimétisme des histones lors d’une infection par le SRAS-CoV-2 et ont décrit les mécanismes par lesquels le virus perturbe la régulation de la chromatine des cellules hôtes.
