En effectuant un dépistage CRISPR à l'échelle du génome sur le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2), des chercheurs américains ont identifié de nouveaux gènes et voies provirales et ont mis en évidence des gènes hôtes qui peuvent réguler la pathogenèse des coronavirus (COVID-19), comme ainsi que la révélation de cibles potentielles pour de nouvelles approches de traitement. Leurs résultats sont actuellement disponibles sur bioRxiv * serveur de préimpression.
Comme aucun vaccin ou thérapeutique approuvé n'est actuellement disponible pour le contrôle des maladies, la pandémie en cours de COVID-19 représente un risque important pour les systèmes de santé publique du monde entier. Cela peut être étendu à d'autres coronavirus émergents, que nous avons déjà rencontrés (tels que le SARS-CoV et MERS-CoV d'origine), ou ceux qui constituent une menace pour l'avenir.
L'entrée du SRAS-CoV-2 (c'est-à-dire, l'agent causal de la maladie COVID-19) dans la cellule représente la première étape de son cycle de vie, qui est médiée par la protéine virale de pointe se liant à l'enzyme de conversion de l'angiotensine du récepteur de la surface cellulaire. 2 (ACE2). Ce dernier est un déterminant important de la gamme d'hôtes et du tropisme cellulaire.
Cependant, un deuxième événement protéolytique est justifié afin d'exposer le peptide de fusion viral et de permettre la fusion membranaire. Cela peut se produire au niveau de la membrane plasmique des cellules cibles par la protéase transmembranaire de type sérine 2 (TMPRSS2) ou dans l'endosome par la Cathepsine L.
Après la fusion de la membrane virale, le matériel génétique viral est libéré dans le cytoplasme des cellules humaines; là, il est traduit et établit des complexes de réplication et de transcription virale avant assemblage et bourgeonnement. Pourtant, les gènes hôtes médiatrices de ces processus restent insaisissables.
Néanmoins, l'identification des facteurs de l'hôte qui permettent le processus d'infection est de la plus haute importance pour informer les mécanismes de pathogenèse du COVID-19, révéler les variations de la sensibilité de l'hôte, mais aussi pour identifier de nouvelles thérapies dirigées par l'hôte avec une large efficacité.
Par conséquent, pour découvrir les gènes hôtes nécessaires à l'infection par le SRAS-CoV-2 et à la mort cellulaire, les chercheurs de Yale, du Massachusetts Institute of Technology, de Harvard, de l'Icahn School of Medicine et de l'Université du Texas ont généré une bibliothèque CRISPR entièrement nouvelle et ont poursuivi la première écran CRISPR à l'échelle du génome avec SARS-CoV-2.
Sommaire
Un effort de dépistage à l'échelle du génome
Afin d'identifier les gènes hôtes indispensables à la survie cellulaire en réponse au SRAS-CoV-2, ce groupe de chercheurs a décidé d'utiliser la lignée cellulaire de singe vert africain Vero-E6, qui se prête très bien à l'infection et au virus du SRAS-CoV-2. effets cytopathogènes induits.
Par conséquent, ils ont effectué deux efforts de dépistage indépendants à l'échelle du génome en utilisant une bibliothèque CRISPR regroupée à l'échelle du génome composée de 83 963 ciblant les ARN guides uniques, avec en moyenne quatre ARN guides uniques par gène, et mille guides témoins non ciblés ARN.
L'identification exacte des gènes proviraux connus ACE2 et Cathepsin L a démontré la qualité technique du criblage, permettant de trouver des gènes supplémentaires ayant la propension à réguler l'infection par le SRAS-CoV-2.
À titre de preuve de principe, les chercheurs ont également testé plusieurs inhibiteurs de petites molécules, ce qui a permis d'identifier trois molécules capables d'inhiber la réplication du SRAS-CoV-2 et la mort cellulaire induite par le virus.
Un écran CRISPR à l'échelle du génome identifie les gènes critiques pour la mort cellulaire induite par le SRAS-CoV-2. (A) Schéma de l'écran groupé. Les cellules Vero-E6 exprimant Cas9 ont été transduites avec la bibliothèque de C. sabaeus à l'échelle du génome via un lentivirus. La population de cellules transduites a alors reçu un traitement simulé ou a été testée avec SARS-CoV-2 dans diverses conditions de culture. Les cellules survivantes de chaque condition ont été isolées et les séquences d'ARNg ont été amplifiées par PCR et séquencées. (B) Graphique du volcan montrant les gènes supérieurs conférant une résistance et une sensibilité au SRAS-CoV-2. Le score z au niveau du gène et -log10 (FDR) ont tous deux été calculés en utilisant la moyenne des cinq conditions Cas9-v2. Les ARNg de contrôle non ciblés ont été regroupés au hasard en ensembles de 4 pour servir de gènes «factices» et sont indiqués en vert. (C) Performance des ARN guides individuels ciblant ACE2, SMARCA4, CTSL et TMPRSS2. Le résidu moyen dans les cinq conditions Cas9-v2 est tracé pour la bibliothèque complète (en haut) et pour les 4 ARN guides ciblant chaque gène. (D) Heatmaps des 25 principaux gènes touchés pour la résistance et la sensibilité, classés par score z moyen dans les conditions Cas9-v2. Les gènes qui sont inclus dans l'un des ensembles de gènes marqués sur (figure 2A) sont colorés en conséquence. Condition a: Cas9v2 D5 2.5e6 Hi-MOI; b: Cas9v2 D5 5e6 Hi-MOI; c: Cas9v2 D2 5e6 Hi-MOI; d: Cas9v2 D10 5e6 Hi-MOI; e: Cas9v2 D5 2.5e6 Lo-MOI.
Une panoplie de gènes impliqués dans l'infection par le SRAS-CoV-2
« Nous avons découvert des gènes impliqués dans divers processus biologiques, notamment le remodelage de la chromatine, la modification des histones, la signalisation cellulaire et la régulation de l'ARN », soulignent les auteurs de l'étude dans leurs principales conclusions dans l'article disponible sur bioRxiv.
Les chercheurs ont évalué 25 de ces gènes avec des ARN monoguidés individuels dans un format matriciel, y compris des gènes proviraux et antiviraux, et des antagonistes de petites molécules identifiés qui offrent une protection contre l'infection par le SRAS-CoV-2 et la mort cellulaire ultérieure.
En bref, les chercheurs ont identifié des facteurs hôtes du SARS-CoV-2 déjà connus – y compris le récepteur ACE2 et la protéase Cathepsine L – mais aussi de nouveaux gènes et voies provirales. Les découvertes récentes consistaient en un complexe spécifique de remodelage de la chromatine et des composants cruciaux de la voie de signalisation du facteur de croissance transformant bêta, qui appartiennent à la superfamille des cytokines multifonctionnelles.
« Il est intéressant de noter que nous n'avons pas détecté plusieurs gènes précédemment impliqués dans l'infection par le SRAS-CoV-2, y compris TMPRSS2, PIKFyve et TPC2, ce qui suggère que ces gènes ne sont pas essentiels de manière intrinsèque aux cellules Vero ou que la redondance fonctionnelle existe avec d'autres gènes », expliquer davantage les auteurs de l'étude.
Les auteurs de l'étude ont également dévoilé la boîte de groupe 1 à haute mobilité alarmin (HMGB1) en tant que composant clé pour la réplication du SRAS-CoV-2; à l'inverse, la perte du complexe chaperon de l'histone H3.3 a préparé les cellules infectées à la mort cellulaire induite par le virus.
Dévoilement des cibles potentielles de traitement
En mettant en évidence un éventail de gènes hôtes proviraux et antiviraux, cette étude a des implications substantielles pour notre compréhension de la pathogenèse, du traitement et de la conception du vaccin COVID-19, notamment en révélant des cibles thérapeutiques potentielles pour le SRAS-CoV-2.
Plus spécifiquement, les gènes et les voies qui ont été identifiés dans cette étude peuvent expliquer la variation de la présentation de la maladie, qui peut être corrélée positivement avec les gènes de résistance, mais négativement corrélée avec les gènes de sensibilisation au niveau cellulaire, tissulaire et de l'organisme.
« Il est fascinant de spéculer que les gènes modifiant la chromatine et les histones identifiés ici contribuent à l'expression d'un programme d'expression génique proviral hétérogène qui régule potentiellement l'ACE2 et d'autres gènes d'interaction virale », affirment les auteurs de l'étude.
En conclusion, cette étude représente le premier dépistage génétique à l'échelle du génome effectué avec n'importe quel coronavirus, avec des résultats largement applicables qui pourraient inciter au développement de traitements dirigés par l'hôte contre les souches pandémiques actuelles et futures de coronavirus.
Le réseau d'ensembles de gènes. Les nœuds représentent des ensembles de gènes considérablement enrichis. La taille de chaque ensemble de gènes est proportionnelle à son score z absolu moyen. Les ensembles de gènes sont colorés par la direction dans laquelle ils marquent. Les bords représentent un chevauchement important entre les ensembles de gènes. La transparence de chaque bord est proportionnelle à la fraction de gènes partagée par deux ensembles de gènes. Les ensembles de gènes ont été regroupés en utilisant l'algorithme d'infomap et l'ensemble le plus central par PageRank est étiqueté pour chaque cluster. L'algorithme Fruchterman – Reingold a été utilisé pour disposer le réseau.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
