Dans une étude récente publiée dans PLOS ONEles chercheurs ont développé un système de réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse-quantitative (RT-qPCR) pour identifier les variants Omicron préoccupants (COV) du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2).
Sommaire
Arrière plan
Pour arrêter la propagation des variants du SRAS-CoV-2 nouvellement découverts et développer des méthodes d’évaluation de leur potentiel pathogène, des mesures de surveillance efficaces sont nécessaires. Cela était crucial pour la variante SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529), qui était prédominante après la propagation de la variante Delta. En particulier dans les pays aux ressources limitées, les procédures de RT-qPCR complètent le séquençage du génome entier. Cependant, des changements dans les séquences d’amorces et de sondes de ciblage des variants nouvellement émergents peuvent entraîner l’échec des RT-qPCR existantes.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, l’équipe a développé une technique de RT-qPCR qui a détecté simultanément les variantes SARS-CoV-2 Delta et Omicron en utilisant une sonde dégénérée qui ciblait spécifiquement la mutation cruciale de la protéine de pointe ΔH69/V70.
Le contrôle synthétique de l’acide ribonucléique (ARN) du SARS-CoV-2 TWIST a été obtenu et utilisé comme variante PCR standard Alpha (B.1.17) dans une série de dilutions 1:10 en sept étapes à une concentration spécifiée. Pour tester si les tests RT-qPCR fonctionnaient avec tous les COV en circulation, des échantillons ont été obtenus de patients atteints d’une infection confirmée par séquençage du génome entier (WGS) par le SRAS-CoV-2 de type sauvage (WT), Alpha, Delta ou variante Omicron. En bref, les centres de test communautaires qui faisaient partie du programme national de test danois ont acquis des écouvillons de gorge et les ont testés pour la positivité du SRAS-CoV-2.
La RT-qPCR a été utilisée pour établir le diagnostic principal de COVID-19. À l’aide du WGS, les identités des lignées BA.1, BA.2, BA.4 et BA.5 ont été validées et des génomes consensuels ont été déposés dans Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID). Les isolats viraux danois inactivés par la chaleur correspondant aux variants Alpha et Delta cultivés dans des cellules Vero E6 ont été considérés comme des témoins positifs prenant en compte les principales mutations (ΔH69/V70 et L452R) présentes dans les variants Alpha, Delta et Omicron. De plus, les cultures ont été isolées, cultivées et diluées.
Deux sondes ont été créées pour chaque mutation majeure du gène de pointe afin d’entreprendre une analyse de discrimination allélique : l’une pour détecter la séquence nucléotidique de type sauvage et l’autre pour détecter la mutation basée sur les alignements de séquences. La présence de SARS-CoV-2 et l’estimation de la charge virale ont été déterminées à l’aide de la technique RT-qPCR qui ciblait le gène de l’enveloppe (E) comme contrôle non spécifique.
Résultats
L’équipe a évalué les propriétés de performance de la qPCR analytique ΔH69/V70 RT avant de les inclure dans la variante-PCR utilisée dans l’étude pour la détection qualitative de la variante Omicron dans les échantillons cliniques. Pour le ΔH69/V70 RT-qPCR, SARS-CoV-2 Omicron, des échantillons cliniques infectés par le variant Alpha ont été utilisés comme témoins positifs tandis que Wuhan et Delta infectés, ainsi que des échantillons négatifs SARS-CoV-2 ont servi de témoins négatifs. Grâce à l’utilisation d’E-Sarbeco RT-qPCR multiplexé avec le ΔH69/V70 RT-qPCR, la présence de SARS-CoV-2 a été vérifiée dans les échantillons positifs.
De plus, les chercheurs ont développé une sonde ΔH69/V70 dégénérée pour identifier la mutation ΔH69/V70 présente dans toutes les variantes connues du SARS-CoV-2. Placer la sonde dégénérée au lieu de celle d’origine qui ciblait ΔH69/V70 a permis aux variantes Alpha et Omicron de restaurer presque entièrement leur intensité de fluorescence finale. L’absence de signal des variants du SARS-CoV-2 qui n’avaient pas la délétion ΔH69/V70 et les contrôles négatifs ont fourni une preuve supplémentaire de la spécificité de la sonde dégénérée. Une sonde WT dans le ΔH69/V70 RT-qPCR a été utilisée pour distinguer les sous-variantes BA.1 et BA.2. La sonde ΔH69/V70 WT a détecté avec succès toutes les variantes du SRAS-CoV-2, y compris WT, Delta et Omicron BA.2, dépourvues du gène ΔH69/V70.
À partir de chacun des 745 échantillons positifs pour le SRAS-CoV-2, des résultats valides de RT-qPCR et une séquence consensuelle du génome ont été obtenus. Un total de 339 échantillons de patients ont été identifiés comme ayant des infections BA.1, tandis que 399 échantillons avaient des infections BA.2, selon l’analyse WGS, indiquant que les deux génomes sont répartis de manière assez égale. Les sept autres échantillons de patients contenaient le génome Delta. La sonde ΔH69/V70 dégénérée a identifié la mutation ΔH69/V70 dans 339 échantillons de patients, corrélant 100 % avec les échantillons Omicron BA.1.
De plus, un signal WT d’origine Delta ou Omicron BA.2 était présent dans 406 échantillons cliniques positifs pour le SRAS-CoV-2. Sept de ces 406 échantillons se sont également révélés positifs pour la mutation 452R, typique de la variation Delta. Indépendamment des identités de sous-lignée BA.1 et BA.2, la séquence L452-WT a été trouvée dans 738 des 745 échantillons de patients, ce qui était corrélé à la variante Omicron. Au total, l’équipe a créé un système RT-qPCR pour Omicron BA rapide .1 et BA.2 distinction à grande échelle, qui a été vérifiée en comparant les données RT-qPCR et WGS.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré qu’en combinant l’analyse de deux mutations de signature distinctes en parallèle, ΔH69/V70 et L452R, l’équipe a effectivement détecté les sous-lignées SARS-CoV-2 Omicron ainsi que la variante Delta.
