Un rapport convaincant, récemment publié sur le bioRxiv* serveur de préimpression, décrit une inhibition étonnamment puissante du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) par les composés mucolytiques à base de thiol P2119 et P2165, en empêchant le pic de virus de se lier à son récepteur de cellule hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2).
Le mécanisme d’action de ces composés semble être via la réduction du disulfure au niveau du domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe qui médie la liaison virus-récepteur et l’entrée virale. Les disulfures affectés ici semblent jouer un rôle allostérique, agissant via une poche de liaison hydrophobe dans le RBD qui est conservée entre plusieurs coronavirus qui infectent les humains.
Sommaire
Arrière-plan
Alors qu’un éventail de stratégies a été exploré pour identifier et développer des antiviraux efficaces et sûrs pour prévenir et traiter l’infection par le SRAS-CoV-2 dans le cadre de la pandémie actuelle de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), beaucoup se sont concentrés sur le blocage de la protéase et de l’ARN polymérase, virale enzymes essentielles à la réplication virale. Malgré des résultats prometteurs, peu ont été cliniquement efficaces.
De même, de nombreuses thérapies visant à bloquer la liaison virale RBD-ACE2 dépendent du développement de molécules qui présentent un ajustement 3-D spécifique aux épitopes viraux impliqués dans ce processus.
L’activité réductrice des disulfures peut avoir un effet antiviral
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé une approche plus simple, exploitant le rôle central des liaisons disulfure dans plusieurs protéines virales nécessaires à la liaison et à l’entrée virales, en particulier dans les coronavirus. Ces liaisons se forment d’abord dans le réticulum endoplasmique (RE) et se stabilisent en présence de molécules oxydantes à l’extérieur de la membrane cellulaire.
Dans le cas du SARS-CoV-2 RBD, quatre paires de disulfures ont été trouvées : Cys480-Cys488, à la surface de liaison ACE2, Cys336-Cys361, Cys379-Cys432 et Cys391-Cys525. Ces trois derniers stabilisent la structure en feuille du RBD.
Les mucolytiques P2119 et P2165 sont en développement préclinique et ont la particularité unique de ne se trouver qu’en extracellulaire. Les deux sont composés d’unités thiol liées respectivement aux sucres glucose ou mannose. Alors que le premier est un monothiol, le second contient deux groupes thiol.
La nature hydrophile des sucres explique qu’ils restent en dehors de la cellule. Malgré leur incapacité à entrer dans la cellule, ils réduisent le titre viral, laissant entendre qu’ils bloquent l’entrée virale plutôt que les processus post-entrée comme la réplication.
Quelles ont été les conclusions ?
P2119 et P2165 ont réduit les titres de SARS-CoV-2 de > 3 log et > 6 log, respectivement, à une concentration de 30 mM. En comparaison directe, le NAC, qui est l’étalon-or pour les mucolytiques cliniques à base de thiol, n’a pas montré d’activité virucide contre ce virus, jusqu’à 100 mM, tandis que le P2165 a inhibé le virus à plus de 3 mM, le réduisant de 1 à 3 logs. .
Contre d’autres coronavirus, y compris le SRAS-CoV et le NL63-CoV, une réduction similaire de 3 à 4 log des titres viraux a été observée à des concentrations de P2119/P2165 comprises entre 10 et 30 mM. Le premier a une protéine de pointe qui est identique à 75% à la pointe du SRAS-CoV-2, avec trois des disulfures ci-dessus. Ce dernier utilise également l’ACE2 comme récepteur hôte, avec des disulfures sur le RBD qui le stabilisent et favorisent la liaison virus-récepteur.
Ces composés ont été testés dans d’autres types de cellules, montrant des réductions comparables (1-4 log) des titres viraux dans la même gamme de concentrations. Cependant, P2165 a une activité inhibitrice plus puissante que l’autre, probablement parce qu’il s’agit d’un dithiol et l’autre d’un monothiol. Les deux semblent partager le même mode d’action.
Des expériences in vitro ont montré que la liaison RBD de pointe de SARS-CoV-2 recombinante à ACE2 était effectivement bloquée par les deux agents via leur réduction des disulfures dans cette région. La concentration efficace demi-maximale (CE50) avec P2165 et P2119 a été réduite d’environ 6 fois et 4 fois, respectivement. La tris(2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), qui est un puissant agent réducteur, inhibe complètement la liaison RBD-ACE2, soutenant davantage ce mécanisme d’action.
Ciblage des pointes par réduction des disulfures
De plus, environ 850 peptides humains extracellulaires contenant de la cystéine se sont révélés réactifs à ces agents, respectivement P2119 et P2165, alors qu’il y avait 49 peptides viraux correspondants. En ce qui concerne la formation de disulfure mixte, observée uniquement avec les monothiols, il y avait 12 et plus de 280 peptides viraux et humains, respectivement. Parmi les peptides viraux mucolytiques affectés, 67 % à 75 % se trouvaient dans la protéine de pointe.
La paire Cys480-Cys488 au niveau de la région de boucle du RBD forme une liaison disulfure stable, qui n’est pas alkylée pendant l’infection. En revanche, Cys432 et Cys525 sont des cystéines hyperréactives et forment donc des liaisons disulfure semi-stables avec leurs cystéines apparentées.
La paire Cys480-Cys488 était la plus accessible au solvant, avec Cys391-Cys525, dans les simulations isolées ou ouvertes-RBD. Cys336–Cys361 et Cys379–Cys432 étaient des disulfures enfouis.
Disulfures allostériques rares
Des études d’analyse d’amarrage moléculaire ont indiqué que ces trois disulfures (autres que Cys480-Cys488) régulent la liaison virus-ACE2 puisque leur réduction provoque des changements de conformation du RBD. Étant donné que les paires Cys379-Cys432 et Cys391-Cys525 sont situées loin du site de liaison ACE2, cela suggère qu’elles sont des modulateurs allostériques de la conformation RBD.
Cela les fait partie d’une catégorie très rare de liaisons disulfure, contrairement aux disulfures structurels et catalytiques plus habituels. La liaison disulfure Cys379-Cys432, lorsqu’elle est réduite, provoque une série de changements dans la région d’interaction de la région CR1 du motif de liaison au récepteur (RBM).
Alors que les changements étaient moins nombreux avec la réduction du disulfure Cys391-Cys525, ils étaient plus répandus, s’étendant également à CR2 et CR3. La conformation RBD résultante était assez différente de la RBD native, telle que le rétrécissement du RBM à proximité de CR1 et CR3, affectant peut-être la reconnaissance du virus-ACE2. Des résultats similaires ont également été trouvés avec Cys480-Cys488, mais dans une moindre mesure.
En fait, cette dernière paire, lorsqu’elle est réduite, a provoqué des changements structurels dans le RBD qui ont entraîné des conformations très différentes pour le RBM. Ces paires sont donc essentielles dans la conformation dynamique du RBD et sont des cibles de mucolytiques à base de thiol.
Le disulfure Cys379-Cys432 pénétrait dans une poche de liaison hydrophobe à l’interface des sous-unités RBD voisines.
Lorsque cette poche est liée par des molécules hydrophobes comme l’acide linoléique, elle stabilise la conformation de la pointe fermée, comme le montre l’inhibition in vitro de la liaison de RBD-ACE2 par les acides gras polyinsaturés ou les vitamines liposolubles, par exemple la vitamine D.
Cependant, cette poche est cachée, avec des alternances respiratoires entre l’état accessible et inaccessible pour ce disulfure Cys379-Cys432. Cette poche de fixation ne peut être accessible que lorsque la pointe est dans la conformation ouverte.
D’autres expériences avec l’amarrage moléculaire ont montré que P2119 et P2165 se liaient à cette poche, le groupe benzène étant enterré et le groupe thiol réducteur pointant directement vers le Cys432. Cela lui permet également d’interagir avec les résidus voisins, à la fois aromatiques et hydrophobes, tout en stabilisant la liaison polyol par des liaisons polaires et des liaisons hydrogène.
Quelles sont les implications ?
L’étude démontre que les coronavirus humains ont été puissamment inhibés par les deux agents car ils réduisent les disulfures clés dans le RBD de pointe du SRAS-CoV-2. Déclenchant des changements de conformation, cela inhibe la liaison pointe-récepteur et donc l’infection.
L’inhibition est indépendante de la formation de liaisons covalentes, mais dépend plutôt de la réduction des disulfures, en particulier des paires sensibles aux mucolytiques, à savoir Cys379-Cys432 et Cys391-Cys525, épargnant la paire Cys480-Cys488, au cours de l’infection. Ce dernier est à la fois conservé parmi les coronavirus et stable, donc lent à subir une réduction.
De plus, les résultats suggèrent que ceux-ci sont allostériques dans leur fonction, provoquant des changements dans la conformation des protéines lorsqu’ils se forment ou se cassent. Les agents thiols se lient à des poches hydrophobes similaires à celles du disulfure Cys379-Cys432 et, en fait, Cys432 forme une liaison covalente avec P2165. Cela pourrait aider à affiner encore davantage l’agent pour améliorer les interactions RBD.
Ces résultats peuvent indiquer un mécanisme alternatif d’inhibition de la liaison virus-ACE2 en neutralisant les anticorps, autre que le blocage physique du RBM – au lieu de cela, en perturbant les disulfures près des épitopes de liaison de ces anticorps. En fait, les agents à base de thiol étaient efficaces contre la variante D614G du SRAS-CoV-2. Ce sera un avantage important compte tenu de l’émergence rapide de nouvelles variantes préoccupantes.
D’autres avantages potentiels de cette approche incluent la capacité de restaurer l’activité antioxydante intracellulaire en augmentant les niveaux de glutathion à la normale. Les mucolytiques à base de thiol réduisent également la sécrétion de mucus en décomposant les disulfures formés entre les molécules dans le mucus, aidant ainsi à éliminer l’obstruction des voies respiratoires et à réduire l’inflammation et l’infection des voies respiratoires.
Ils sont également plus sûrs, avec un index thérapeutique plus élevé que le médicament approuvé N-acétyl cystéine (NAC).
Ces découvertes collectives établissent la vulnérabilité des coronavirus humains aux mucolytiques à base de thiol réutilisés et jettent les bases du développement de ces composés en tant que traitement potentiel, préventif et/ou adjuvant contre l’infection», concluent les chercheurs.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
