Une équipe de chercheurs de l’Université de Nanjing en Chine a utilisé plusieurs tests, microscopie à force atomique et simulations pour déterminer que la mutation N501Y dans le domaine de liaison au récepteur du virus (RBD) augmentait l’interaction du virus avec l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) récepteur.
Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), l’agent causal de la pandémie de coronavirus en cours de 2019 (COVID-19), est un virus à ARN enveloppé. La protéine de pointe, qui a une sous-unité amino-terminale S1 et une sous-unité carboxyl-terminale S2, sur l’enveloppe, aide le virus à infecter les cellules hôtes.
La sous-unité S1 de la RBD reconnaît et se lie à la cellule hôte et joue un rôle clé dans la transmission zoonotique des coronavirus et l’infectivité des humains. La sous-unité S2 est responsable de la fusion membranaire. La première étape de l’infection par le SRAS-CoV-2 est l’interaction RBD avec le récepteur cellulaire ACE2 humain.
Deux nouvelles variantes du virus, qui ont apparemment augmenté la transmissibilité, ont été récemment découvertes au Royaume-Uni (B.1.1.7) et en Afrique du Sud (B.1.351). Les deux ont la mutation N501Y sur le pic RBD, et le mutant sud-africain a deux autres mutations, K417N et E484K, sur le RBD.
Les rapports indiquent que les vaccins à ARNm approuvés ont un niveau élevé de neutralisation du variant B.1.1.7, mais un niveau inférieur pour le variant B.1.351. Les études sur les anticorps neutralisants dans les essais de phase II et de phase III indiquent qu’ils ne sont pas capables de neutraliser B.1.351. Parce que les mutations sont sur le RBD, il est important de comprendre comment exactement elles se lient à ACE2.
Affinité de liaison des mutations à ACE2
Les chercheurs ont utilisé des tests de liaison cellulaire, des cinétiques et des simulations pour comprendre la liaison des virus mutants à ACE2. Ils ont rapporté leurs résultats dans un article publié sur le bioRxiv * serveur de pré-impression.
La microscopie confocale de l’ACE2 dans les cellules HEK293 a montré que l’ACE2 est principalement présente dans la membrane et le réticulum endoplasmique. Des tests de liaison à la surface cellulaire utilisant un marquage fluorescent ont clairement montré la liaison de ACE2 à la RBD.
En utilisant un test de liaison par compétition, l’équipe a découvert que le N501Y dans le mutant B.1.1.7 présentait une affinité de liaison 4 fois supérieure à ACE2 par rapport au virus de type sauvage RBD. Les mutations K417N et E484K ont montré une affinité de liaison légèrement inférieure. Lorsque les trois mutations étaient présentes ensemble, l’affinité de liaison était similaire à celle du type sauvage.
Les auteurs ont utilisé la spectroscopie de force à molécule unique basée sur la microscopie à force atomique (AFM-SMFS) pour mesurer la force de liaison des RBD avec les trois mutations à ACE2. Le RBD est modifié pour permettre la fixation à une pointe AFM revêtue de peptide. Les cellules HEK293 exprimant ACE2 ont été liées sur une boîte de Pétri. Lorsque la pointe AFM revêtue de RBD est déplacée vers la boîte de Pétri, une liaison entre ACE2 et RBD se produit. Lorsque la pointe recule, les interactions sont interrompues. L’équipe a obtenu une carte de force non contraignante en faisant cela des centaines de fois en surface.
Ils ont découvert que les mutants RBD avec N501Y et les trois mutations avaient une force de déliaison plus élevée que celle du RBD sans le mutant. Les calculs ont montré que les taux de dissociation des liaisons des deux types de RBD mutants sont plus lents que ceux du RBD de type sauvage. Le test de résonance plasmonique de surface a révélé que toutes les mutations RBD avaient une affinité de liaison plus élevée, une augmentation de près de 10 fois, à ACE2 que le virus de type sauvage.
Les chercheurs ont également construit des modèles pour les mutants RBD et le complexe ACE2 et ont utilisé des simulations de dynamique moléculaire dirigée (SMD) pour étudier les mécanismes de déliement sous la force. En tirant le RBD avec la mutation N501Y, après une certaine force, il a changé sa conformation et a formé une autre interaction avec Y501 et Y41 de ACE2. Le N501Y peut former une interaction pp avec Y41 de ACE2, conduisant à une interaction plus forte.
Expérience AFM-SMFS pour quantifier la force entre les RBD et ACE2 sur la cellule vivante. a) Les schémas des processus de mesure AFM-SMFS montrent comment l’interaction est quantifiée. La RBD avec un NGL N-terminal est immobilisée sur une pointe d’AFM revêtue de GL par la ligase OaAEP1, qui reconnaît les deux séquences et les lie dans une liaison peptidique 1). En approchant la pointe de l’AFM vers la cellule cible 2), RBD se lie à ACE2 3). Ensuite, la pointe se rétracte et le complexe se dissocie finalement, conduisant à un pic de force de déliement 4). b) L’image montrait la cellule HEK293 transfectée par ACE2-mCherry rougeâtre mesurée sous la pointe par un microscope à fluorescence inversé. c) Les courbes force-extension représentatives ne montrent aucun événement de liaison (courbe 1) et des événements de liaison spécifiques entre les complexes RBD-ACE2 avec un pic de force de déliaison (courbes 2-4). D’après l’histogramme de force (en médaillon), RBDN501Y et RBDTriple ont montré des forces plus élevées que 57 pN et 56 pN que le RDB (49 pN). d) Le diagramme en boîte des probabilités de liaison spécifiques entre les trois RBD et la cellule a indiqué une probabilité plus élevée pour les deux mutants des expériences AFM sous les cinq vitesses différentes. La case indique les 25e et 75e centiles. e) f) Le graphique entre le taux de chargement et les forces de déliement les plus probables des complexes a montré une relation linéaire. Les données sont ajustées au modèle de Bell-Evans pour extraire le hors-débit.
Les mutations augmentent la liaison du virus à l’ACE2
Ainsi, tous les différents tests montrent que le N501Y est plus important que les deux autres mutations dans la liaison à ACE2. Alors que K417N a diminué l’interaction, E484K a légèrement augmenté l’interaction. Ainsi, lorsque les trois mutations sont présentes, l’effet net est similaire à celui lorsque seule la mutation N501Y est présente.
Dans une autre variante virale originaire du Brésil identifiée en janvier 2021, la mutation N501Y est présente, en dehors d’autres mutations.
Par conséquent, nous pensons que le N501Y est une mutation critique pour affecter la transmission du COVID-19 en renforçant l’interaction entre RBD et ACE2 », écrivent les auteurs.
Cette mutation aidera le virus à se lier à l’hôte plus longtemps, lui laissant plus de temps pour fusionner avec la membrane de la cellule hôte, augmentant ainsi l’infectivité.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
