Des chercheurs de Ceres Nanosciences, aux États-Unis, ont présenté un flux de travail d’enrichissement par nanopiège pour capturer et concentrer les particules du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) à partir d’échantillons de diagnostic et artificiels.
Cette approche améliore les protocoles d’extraction d’ARN à base de colonnes et de billes magnétiques, offrant des améliorations significatives des résultats de séquençage sur la plate-forme de séquençage MinION d’Oxford Nanopore technologies (ONT). La sortie du séquençage a démontré des lectures virales significativement plus cartographiées et une couverture de séquence améliorée de 20 à 80 % à partir d’échantillons de diagnostic avec de faibles titres de virus.
Étude : Les particules Nanotrap améliorent le séquençage des nanopores du SRAS-CoV-2 et d’autres virus respiratoires. Crédit d’image : Unitone Vector/Shutterstock
L’équipe a également démontré la même approche pour enrichir deux autres virus respiratoires, à savoir le virus Influenza A et le virus respiratoire syncytial, soulignant son potentiel pour améliorer les résultats de la PCR en temps réel et du séquençage pour les virus respiratoires autres que le SRAS-CoV-2.
Sommaire
Fond
L’évolution génétique continue du SARS-CoV-2 met en évidence la nécessité d’identifier et de surveiller en permanence l’émergence de nouvelles variantes virales, et donc spécifiquement les demandes de technologies de séquençage précises rapidement déployables.
Ici, le séquenceur ONT MinION est mis au point. En tant que stratégie de détection portable et relativement peu coûteuse, elle peut être utilisée pour une détection et une caractérisation rapides sur site des variantes virales sur le terrain. Cependant, l’utilité de ces outils de séquençage portables est limitée par les problèmes de précision de l’appel de base qui surviennent dans les échantillons avec une concentration d’acide nucléique insuffisante.
L’équipe de Ceres Nanosciences, dans leurs récentes recherches publiées sur le serveur de préimpression bioRxiv*, a résolu cette limitation en utilisant une technologie d’enrichissement de particules d’hydrogel magnétique basée sur l’affinité (technologie d’enrichissement de particules Nanotrap) qui peut concentrer les particules virales, conduisant à une détection améliorée de nombreux agents viraux, y compris le SRAS-CoV-2. Avec un appel de base supérieur, les outils bioinformatiques peuvent distinguer en toute confiance la mutation génétique dans la variante de l’erreur de la machine.
Qu’ont fait les chercheurs ?
L’équipe a développé trois workflows pour démontrer la robustesse et la facilité d’utilisation de la technologie des particules Nanotrap : une méthode manuelle avec une extraction d’ARN sur colonne (Flux de travail des particules Nanotrap 1), une méthode manuelle avec une extraction d’ARN par billes magnétiques (Flux de travail de particules Nanotrap 2), et une méthode automatisée avec une extraction d’ARN à base de billes magnétiques (Flux de travail de particules Nanotrap 3).
Ces flux de travail ont été effectués dans le SARS-CoV-2 artificiel (dopé avec des dilutions en série de 1:10 de SARS-CoV-2 inactivé par la chaleur à partir de 106 TCID50/mL à 102 TCID50/mL) des milieux de transport viral (VTM) ainsi que des échantillons de VTM de diagnostic restants. Les workflows de particules Nanotrap (+NT) ont été comparés aux workflows sans particules Nanotrap (-NT).
L’ARN extrait a été préparé pour le séquençage à l’aide du protocole de séquençage ARTIC nCoV-2019 et séquencé sur la plate-forme de séquençage ONT Mk1C, suivi d’une analyse des données.
De plus, une RT-PCR en temps réel a été réalisée sur l’ARN extrait des trois flux de travail pour identifier une corrélation potentielle entre les deux tests et confirmer la présence du SRAS-CoV-2.
Les particules Nanotrap améliorent les résultats du séquençage
Avec Nanotrap Workflow 1, les particules Nanotrap ont considérablement amélioré les résultats de séquençage à diverses concentrations de virus par rapport au workflow sans particules Nanotrap. Une augmentation de 6,0 fois des lectures mappées sur le SRAS-CoV-2 a été observée à 106 TCID50/mL et une augmentation de 2,0X a été observée à 105 DICT50/mL. Ces améliorations étaient statistiquement significatives. La détection virale en qPCR en temps réel a également été considérablement améliorée par deux seuils de cycle de PCR (Ct) sur les quatre premières dilutions en série.
Comme les extractions d’ARN sur colonne sont plus appropriées lorsque l’on travaille avec moins d’échantillons, l’équipe a essayé d’évaluer la capacité des particules Nanotrap à améliorer le séquençage lors de l’utilisation d’ARN extrait via des billes magnétiques (Nanotrap Workflow 2). Ici, une amélioration de 1,9X dans les lectures cartographiées SARS-CoV-2 a été observée à 106 TCID50/mL et une amélioration de 1,4X à 105 TCID50/mL. De plus, la détection qPCR en temps réel du SRAS-CoV-2 a été améliorée, offrant une amélioration moyenne de 1,5 Ct à 106-dix2 DICT50/mL.
« Les résultats de la RT-PCR ont montré que l’enrichissement des particules Nanotrap était efficace pour les échantillons à plus faible concentration pour les deux flux de travail, suggérant potentiellement que sur une plate-forme de séquençage alternative avec une plus grande sensibilité globale, les particules Nanotrap pourraient également améliorer le séquençage de ces échantillons de virus à plus faible titre », souligne l’équipe.
Pour tester l’efficacité des particules Nanotrap avec de vrais échantillons cliniques, l’équipe a évalué les flux de travail des particules Nanotrap à l’aide de 10 échantillons d’écouvillons cliniques résiduels de diagnostic avec des valeurs qPCR Ct rapportées allant de 24 à 35. L’équipe a quantifié à la fois le nombre total de lectures virales cartographiées et le pourcentage de génome associé. couverture à 30x la profondeur des échantillons traités.
Nanotrap Particle Workflow 1 a entraîné une amélioration significative de 7 fois du nombre total de lectures virales cartographiées sur les 10 échantillons résiduels de diagnostic, ce qui a en outre entraîné une augmentation moyenne de la couverture du génome viral de 52 % par rapport aux échantillons traités sans particules Nanotrap. La RT-PCR a confirmé la présence du SARS-CoV-2 avec une amélioration moyenne de 4 Ct par rapport à aucun échantillon de particules Nanotrap.
La méthode automatisée Nanotrap Particle Workflow 3 sur le système automatisé KingFisher Apex a également démontré des résultats améliorés, avec une amélioration moyenne de 42X dans le total des lectures virales cartographiées qui correspond à une augmentation moyenne de 51 % de la couverture du génome viral par rapport aux échantillons (-NT). Encore une fois, la qPCR a confirmé la présence du SRAS-CoV-2 pour les 10 échantillons avec une amélioration moyenne de 3,7 Ct.
Figure 1 : Le flux de travail 1 des particules Nanotrap améliore le séquençage des échantillons de diagnostic résiduel du SRAS-CoV-2. 10 échantillons résiduels de diagnostic positifs pour le SRAS-CoV-2 ont été traités à l’aide du flux de travail de particules Nanotrap 1 [+NT] ou le Kit RNEasy seul [-NT]. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 et ont été analysés par Viral Mapped Reads to SARS-CoV-2 (A), Viral Genome Coverage à 30x profondeur (B) ou RT-PCR (C). [+NT] ont été comparés à [-NT] par un test t apparié afin d’évaluer l’importance d’une détection virale accrue (D), (E). ***p<0,001.
Détection améliorée d’autres virus respiratoires
Pour confirmer la capacité d’enrichissement des particules Nanotrap pour d’autres virus et pas seulement pour le SRAS-CoV-2, l’équipe a également testé l’extraction d’ARN avec le flux de travail 1 sur des échantillons VTM artificiels dopés avec le virus de la grippe A (H1N1) et le VRS. De manière notable, les particules Nanotrap ont pu améliorer les résultats de séquençage pour les deux virus. Comme pour le SRAS-CoV-2, les particules Nanotrap ont multiplié par 4 les lectures virales cartographiées pour la grippe A et le RSV par rapport aux échantillons traités sans particules Nanotrap. De plus, les particules Nanotrap ont considérablement amélioré la détection de l’ARN viral par qPCR. Sur la base de cette expérience, l’équipe suggère que les particules Nanotrap peuvent être utilisées pour identifier et améliorer les résultats de séquençage de plusieurs virus dans des échantillons de VTM.
Le protocole de préparation de la bibliothèque de séquençage implique l’utilisation de diverses enzymes qui peuvent être affectées négativement par la présence de matériel biologique préjudiciable présent dans les vrais échantillons de diagnostic d’origine humaine. Le prétraitement avec des particules Nanotrap permet la capture de matériel viral tout en réduisant les débris de la cellule hôte et d’autres matières contaminantes. L’équipe suggère donc que les flux de travail sans particules Nanotrap sont plus susceptibles d’être impactés par l’inhibition.
Conclusion
Comme la couverture du génome viral a été considérablement augmentée et a été presque améliorée de 80% dans la majorité des échantillons de diagnostic, l’équipe suggère que l’utilisation de particules Nanotrap peut permettre l’hébergement d’un plus grand nombre d’échantillons cliniques en un seul passage.
L’équipe souligne la nécessité d’un flux de travail simple et rapide afin d’atteindre un débit d’échantillons élevé dans un cadre de santé publique et recommande donc le Nanotrap Workflow 3 automatisé pour de tels paramètres.
Il convient de noter que cette méthode automatisée permettrait le traitement de 96 échantillons en 1 heure, ce qui est nettement plus rapide et beaucoup plus convivial que la méthode d’extraction manuelle sur colonne, ce qui en fait une proposition attrayante pour les laboratoires à débit moyen à élevé.
De plus, les flux de travail des particules Nanotrap peuvent être utilisés pour améliorer la détection virale à grande échelle par séquençage, comme le montrent les expériences de séquençage menées sur la grippe A et le RSV.
Dans l’ensemble, les observations suggèrent que l’enrichissement des particules Nanotrap permet le séquençage d’échantillons cliniques à titre inférieur dans VTM à l’aide du séquenceur ONT MinION, qui autrement n’aurait peut-être pas été adapté au séquençage.
Une méthode de concentration de particules Nanotrap associée à une plate-forme de séquençage ONT permet un outil de séquençage puissant qui pourrait potentiellement être déployé dans une zone sans accès à des équipements de séquençage ou de traitement d’échantillons plus traditionnels », conclut l’équipe.
Figure 2: Le flux de travail 3 des particules Nanotrap améliore la sortie de séquençage des échantillons de diagnostic du SRAS-CoV-2 restants. 10 échantillons résiduels de diagnostic positifs pour le SRAS-CoV-2 ont été traités à l’aide du flux de travail Nanotrap Particle 3 [+NT] ou le kit MagMAX seul [-NT]. Les échantillons ont ensuite été séquencés sur une Flow Cell ONT MinION R.9 et ont été analysés par Viral Mapped Reads to SARS-CoV-2 (A), Viral Genome Coverage à 30x profondeur (B) ou RT-PCR (C). [+NT] ont été comparés à [-NT] par un test t apparié afin d’évaluer l’importance d’une détection virale accrue (D), (E). *p<0,05, **p<0,01.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
