En combinant des techniques avancées d’édition génétique, les scientifiques ont identifié des mutations clés qui influencent la croissance tumorale et la résistance aux médicaments dans le cancer du poumon, ouvrant ainsi de nouvelles voies pour des thérapies anticancéreuses sur mesure.
Étude : Analyse multimodale de variantes génétiques avec édition de base et d’origine. Crédit d'image : Andrii Yalanskyi/Shutterstock
Dans une étude récente publiée dans la revue Biotechnologie naturelledes chercheurs suisses ont utilisé l'édition de base et l'édition principale pour créer et analyser un large éventail de variantes du gène du récepteur du facteur de croissance épithélial (EGFR) dans plusieurs lignées cellulaires, y compris des cellules cancéreuses et non cancéreuses, afin d'étudier leurs effets sur la progression du cancer et les médicaments. résistance. Ils ont découvert des mutations connues et nouvelles liées de manière significative à l'activation de l'EGFR et à la réponse aux médicaments, démontrant la précision de la méthode et révélant de nouvelles voies affectant la croissance tumorale et les mécanismes de résistance aux médicaments.
Sommaire
Arrière-plan
Malgré les progrès dans le séquençage du génome, plusieurs variantes génétiques restent classées comme variantes de signification incertaine (VUS), compliquant le diagnostic et le traitement de la maladie. Cela est particulièrement évident dans les variantes de l’EGFR liées au cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), où environ 50 % des variantes de l’EGFR sont des VUS. Les traitements actuels, y compris les inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) qui ciblent l'EGFR, sont moins efficaces contre les mutations non canoniques, entraînant de mauvais résultats et une résistance aux médicaments. De nouvelles méthodes telles que les tests multiplex et les criblages basés sur de courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR) facilitent l'évaluation des variantes, mais elles manquent actuellement de l'échelle, de la spécificité et de la précision nécessaires pour analyser toutes les mutations possibles.
La technologie d'édition de base a amélioré la précision, mais est limitée par des modifications involontaires et des types de mutations restreints. L'édition principale, une méthode plus avancée, permet l'introduction précise de diverses mutations, y compris des insertions et des délétions, offrant ainsi un moyen à haut débit d'évaluer la pathogénicité du VUS et d'ouvrir de nouvelles voies dans le traitement personnalisé du cancer. Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé une combinaison d’édition de base et d’édition principale pour effectuer des analyses mutationnelles à haute résolution de la séquence codante entière du gène EGFR afin d’identifier les mutations connues et nouvelles liées à la progression du cancer et à la résistance aux médicaments dans divers types de cellules.
À propos de l'étude
Les chercheurs ont utilisé des cellules MCF10A, qui dépendent de l’EGFR de type sauvage pour leur croissance, pour évaluer le pouvoir pathogène des variantes de l’EGFR. Ils ont introduit des mutations spécifiques dans l'EGFR qui favorisent l'activation à l'aide d'éditeurs de bases de cytosine et d'adénine (BE3.9max et ABE8e) via la délivrance lentivirale, en utilisant une bibliothèque de 1 496 acides ribonucléiques à guide unique (sgRNA) ciblant tous les exons de l'EGFR et les sites régulateurs clés. Après édition et privation d’EGF, les chercheurs ont séquencé les sgARN pour identifier les mutations affectant la viabilité cellulaire. Dans un examen de suivi, ils ont évalué les mutations de l'EGFR associées à la résistance aux médicaments en traitant les cellules MCF10A avec du géfitinib ou de l'osimertinib et en analysant les bibliothèques de sgARN pour identifier de nouveaux variants résistants aux médicaments.
Pour élargir leur criblage mutationnel, les chercheurs ont également utilisé l’édition principale pour introduire une gamme plus large de mutations de l’EGFR, notamment celles des bases de données ClinVar et COSMIC. Ils ont conçu des cellules MCF10A sans le gène MLH1 pour améliorer l’efficacité de l’édition principale et ont fourni des ARN guides d’édition principaux (pegARN) ciblant 14 mutations EGFR connues et significatives via des vecteurs lentiviraux. L'inclusion de mutations synonymes dans les pegRNA a permis aux chercheurs d'examiner leur impact sur l'efficacité de l'édition.
Résultats et discussion
Les deux éditeurs de base ont atteint une efficacité d'édition de 95 à 97 % dans les cellules MCF10A, les mutations s'accumulant au fil du temps et certains allèles présentant plusieurs modifications. Le criblage a identifié un épuisement des sgRNA essentiels, confirmant la capacité du criblage à détecter les mutations qui altèrent la viabilité cellulaire. Notamment, les mutations affectant les sites d’épissage, les mutations non-sens et faux-sens de l’EGFR étaient associées à des effets de perte de fonction.
L'analyse a révélé des mutations connues et plusieurs nouvelles de l'EGFR liées à la résistance aux médicaments, en particulier dans la poche de liaison à l'ATP du domaine tyrosine kinase de l'EGFR. Pour le géfitinib, des mutations bien connues comme Thr790Met ont été identifiées, ainsi que des mutations jusqu'alors non caractérisées à proximité de la poche de liaison, notamment Val726, Met766 et Thr854, validées comme conférant une résistance. Pour l'osimertinib, des mutations telles que Thr790Ala; Gln791Arg et Val845Ala ont été enrichies, ainsi que des mutations dans le domaine C-terminal, suggérant des mécanismes de résistance distincts. Ces résultats ont mis en évidence des interactions intramoléculaires spécifiques et des changements structurels au sein de l'EGFR qui contribuent à la résistance contre divers ITK.
L'édition de base a également révélé une vision nuancée des mutations affectant la sensibilité aux médicaments. Par exemple, la mutation Val845Ala était résistante à l’osimertinib mais sensible au géfitinib, tandis que d’autres mutations, comme Lys852Glu, provoquaient une résistance aux deux médicaments. Des mutations secondaires, telles que Thr790Met, ont encore amélioré la résistance des cellules PC-9 mutantes EGFR. L'édition principale a introduit près de 92 % des variantes d'EGFR répertoriées dans ClinVar et COSMIC, identifiant de nouvelles mutations, notamment des insertions de l'exon 20 et des mutations de domaines extracellulaires liées à la résistance.
L’étude démontre la force de la base de précision multimodale et de l’édition principale et fournit des informations sur l’activation de l’EGFR et la résistance aux médicaments. Cependant, elle était limitée par sa dépendance à l'égard de la prolifération indépendante de l'EGF comme indicateur de la signalisation de l'EGFR et n'analysait pas les interactions des récepteurs ni les effets hétérozygotes. Des études futures pourraient résoudre ces problèmes à l’aide de modèles cellulaires supplémentaires et de lignées cellulaires modifiées.
Conclusion
En conclusion, la présente étude a développé un cadre d'analyse mutationnelle robuste et à haute résolution qui combine les capacités d'édition de base et d'édition principale pour analyser les variantes génétiques impliquées dans la résistance aux médicaments et la croissance tumorale. L’élargissement de cette approche à un éventail plus large d’éléments génétiques et de modèles cellulaires, y compris les cellules humaines primaires, contribuera à éclairer la pertinence clinique de diverses variantes génétiques et à soutenir un traitement personnalisé du cancer.
