Dans une étude récente publiée dans Génétique de la natureles chercheurs ont effectué une édition du génome par saturation (SGE) du gène de la protéine 1 associée au gène BRCA1 (BAP1), dont le dysfonctionnement est lié au cancer et à un développement neurologique altéré.
Sommaire
Arrière-plan
Les mutations héréditaires de perte de fonction (LOF) du gène BAP1 entraînent une susceptibilité tumorale, certaines étant liées à des problèmes de développement neurologique. Des variantes d'importance inconnue créent un syndrome de prédisposition tumorale autosomique dominante, qui entraîne des complications lors du traitement du patient.
Les critères de dépistage récents pour les personnes présentant des mutations germinales pathogènes du gène BAP1 sont essentiels pour identifier les groupes à risque et améliorer les recommandations de surveillance. L'identification des mutations somatiques de type disruptif du gène BAP1 dans les tumeurs malignes peut aider à adapter le traitement du cancer.
À propos de l'étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé SGE pour caractériser les variations d’un seul nucléotide dans le gène BAP1, améliorant ainsi les efforts de médecine de précision.
Les chercheurs se sont concentrés sur les variations de signification inconnue (VUS) du gène BAP1, qui sont essentielles pour le traitement des patients. Ils ont étudié la fonction des polymorphismes germinaux et somatiques du gène BAP1 dans la propension tumorale et les thérapies oncologiques ciblées. Ils ont étudié les corrélations des variations du gène BAP1 avec des cancers tels que le mélanome cutané, le mélanome uvéal, le cholangiocarcinome, le mésothéliome, le méningiome et le cancer du rein.
Les chercheurs ont mené des expériences sur 18 108 variations distinctes, dont 6 196 présentaient des fonctionnalités aberrantes. Ils ont ensuite utilisé ces résultats pour évaluer les relations phénotypiques dans la United Kingdom Biobank, une collection de tumeurs basée sur la population, les pedigrees du cancer et ClinVar.
Les chercheurs ont développé une souche knockout (KO) de l'ADN ligase 4 HAP1 (LIG4) qui comprenait l'intégration génomique d'un Cas9 généré par clonage (HAP1-A5). Ils ont affiné les plasmides et les méthodes de transfection, en examinant tous les exons codant pour BAP1 sur cinq périodes. En outre, ils ont mené deux études différentes pour cibler chaque zone SGE.
L'aptitude cellulaire a été utilisée comme indicateur biologique de la fonction de BAP1, montrant son importance et l'efficacité de la SGE dans les cellules HAP1. Un criblage focalisé de la protéine 9 associée aux répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR-Cas9) a été réalisé, avec 193 sgRNA et bibliothèques de variantes réparties sur les 22 zones cibles de BAP1.
Les chercheurs ont effectué des analyses fonctionnelles de l'architecture et de la conservation des gènes, classant les variations en catégories fonctionnelles. Les variants avec un taux de fausses découvertes (FDR) ≥ 0,01 ont été classés comme inchangés, tandis que ceux avec un FDR ≤ 0,01 et un score fonctionnel négatif ont été classés comme appauvris. Les variants avec un FDR ≤ 0,01 et un score fonctionnel positif ont été classés comme enrichis. Les chercheurs ont comparé cette mesure aux résultats de SGE et ont testé la fiabilité des scores fonctionnels et des classifications pour chaque variant en comparant les changements de repli log2 (LFC) de différentes études d'édition du génome.
Les chercheurs ont comparé le test BAP1 SGE au cadre de preuves de l'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) pour établir son utilité pour l'interprétation des variantes. Ils ont étudié les variantes BAP1 dans le cancer et le développement neurologique et les ont classées comme fortement déficientes ou légèrement déficientes. Ils ont utilisé une étude d'association phénotypique (PheWAS) pour identifier les variantes déficientes et ont développé des caractéristiques phénotypiques de type cancer et des masques de test de charge de variantes rares.
Ils ont également évalué le lien entre les mutations du gène BAP1 de la UK Biobank et les aspects quantitatifs des mélanomes uvéaux à l'aide des données de séquençage de l'acide ribonucléique (RNA-seq) du Cancer Genome Atlas. Ils ont également examiné les données de séquençage tumoral de 394 756 échantillons de patients dans la base de données Foundation Medicine pour identifier de nouvelles variantes du gène BAP1.
Résultats
Des mutations germinales perturbatrices de type non synonyme du gène BAP1 ont été associées à des diagnostics de cancer et à une augmentation des taux d'IGF-1 (facteur de croissance analogue à l'insuline-1), indiquant un mécanisme pathogénique possible et une cible thérapeutique. Le score fonctionnel a classé avec précision les variantes, avec une sensibilité > 99 % et une spécificité > 98 % et une valeur d'aire sous la courbe (AUC) > 0,999.
La méthode SGE révisée a amélioré la qualité de l'expérience en établissant l'essentialité de BAP1 dans la lignée cellulaire HAP1 LIG4 KO, en augmentant l'activité de Cas9 et en maintenant une haploïdie robuste. La procédure SGE affinée a amélioré l'efficacité de la transfection parmi les cellules HAP1 de moins de 5,0 % à plus de 60 %. L'essentialité de BAP1 a permis la séparation des conséquences mutationnelles, les variants stop-gained et frameshift ayant principalement des scores fonctionnels négatifs.
Les variations faux-sens et les suppressions de codons ont produit des scores avec une distribution bimodale, permettant aux chercheurs d'identifier les résidus et domaines critiques de la protéine BAP1. Sur les 18 108 variations de BAP1, 11 912 étaient constantes, 5 665 appauvries et 531 enrichies. Les variations inchangées n'ont reçu aucune évaluation fonctionnelle, mais les variantes enrichies ont obtenu de meilleurs scores. L'équipe a observé quelques variantes synonymes appauvries à l'écran. Les variantes appauvries de type synonyme ont montré des scores SpliceAI significativement plus élevés que les variantes synonymes inchangées. Les versions appauvries ont une plage de scores plus large.
Le domaine UCH N-terminal conservé de BAP1 était plus résistant aux mutations faux-sens et aux suppressions de codons. Les classifications fonctionnelles calculées avec les LFC et les FDR de la bibliothèque A ou B ont donné lieu à une concordance de classification des variantes de 90 %. Les chercheurs ont constaté que 99,8 % des variations dans l'ensemble de vérité de pathogénicité présentaient une diminution anticipée, tandis que 97 % étaient inchangées ou enrichies. La classification fonctionnelle des tests et de la SGE est assez similaire, ce qui permet l'identification simultanée d'un hypomorphe probable.
Conclusion
L’étude a montré qu’une évaluation fonctionnelle approfondie des loci à l’aide de SGE peut améliorer le diagnostic des patients, la compréhension biologique des causes de la maladie et la compréhension de base de la fonction des gènes et des protéines.
