Une équipe de scientifiques basés au Royaume-Uni a récemment développé une méthode de réaction en chaîne par polymérase à sonde spécifique à un allèle qui peut détecter avec précision différentes variantes/lignées du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) dans des échantillons respiratoires. La méthode peut détecter des variantes virales même dans des échantillons avec un faible ARN viral ou un ARN viral dégradé. L’étude est actuellement disponible sur le medRxiv* serveur de préimpression.
Étude : Discrimination de lignée hautement sensible des variants du SRAS-CoV-2 par le biais d’une réaction en chaîne par polymérase de sonde spécifique à l’allèle. Crédit d’image: Fit Ztudio/Shutterstock
Sommaire
Fond
La pandémie actuelle de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est devenue une crise majeure de santé publique, avec 247 millions d’infections et 5 millions de décès. Malgré le développement et le déploiement rapides de vaccins potentiels, une augmentation continue de la trajectoire pandémique a été observée dans le monde. Cela pourrait être dû à l’émergence de nouvelles variantes virales avec de multiples mutations de pointe qui rendent le virus résistant à la neutralisation médiée par les anticorps. Ainsi, une détection rapide et précise des variantes virales est importante pour détecter la transmission virale et évaluer le risque.
Les méthodes de séquençage de nouvelle génération du génome entier sont considérées comme la norme d’or pour détecter les variantes virales. Les échantillons viraux utilisés dans ces méthodes doivent avoir une bonne qualité et un niveau élevé d’ARN viral. Cependant, les échantillons prélevés sur des patients à la phase ultérieure de l’infection contiennent souvent un faible niveau d’ARN viral. De plus, une dégradation rapide de l’ARN pourrait se produire en raison d’une mauvaise manipulation des échantillons pendant le transport et le stockage. Ces facteurs pourraient essentiellement limiter l’utilisation généralisée des méthodes de séquençage de nouvelle génération.
Dans la présente étude, les scientifiques ont développé une méthode basée sur la réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR) en temps réel qui peut détecter des variantes virales même dans des échantillons à faible teneur en ARN viral ou en ARN dégradé.
La méthode
La méthode est appelée PCR à sonde spécifique d’allèle. Il utilise deux sondes marquées par fluorescence avec des affinités de liaison différentielles qui ciblent des polymorphismes nucléotidiques uniques spécifiques à une variante dans le génome du SRAS-CoV-2.
Les scientifiques ont utilisé cette méthode pour détecter des variantes virales dans deux groupes de patients infectés par le SRAS-CoV-2. Dans un essai mené au Royaume-Uni, ils ont analysé 717 échantillons respiratoires par la méthode de détection du variant alpha du SRAS-CoV-2 en ciblant la mutation de pointe D1118H. Dans un autre essai mené au Brésil, ils ont analysé 365 échantillons par la méthode pour détecter les variants P1 et P2 en ciblant respectivement la mutation de pointe K417T et la mutation du cadre de lecture ouvert 1a (ORF1a) L3468V.
En outre, ils ont comparé la sensibilité et la spécificité de la méthode PCR à sonde spécifique à l’allèle avec les méthodes de séquençage de nouvelle génération dans les deux essais.
Remarques importantes
L’analyse des échantillons des deux essais a révélé que la méthode PCR par sonde spécifique à l’allèle a une capacité 25 % plus élevée que la méthode de séquençage de nouvelle génération pour détecter les variantes virales dans des échantillons avec une large gamme de charges virales.
L’analyse d’échantillons avec de l’ARN viral dégradé a révélé que la qualité de l’ARN n’affecte pas la fonctionnalité de la méthode PCR de sonde spécifique à l’allèle. Il pourrait effectivement séquencer 95 % des échantillons dégradés, tandis que la méthode de séquençage de nouvelle génération ne pourrait séquencer que 0 à 11 % des échantillons dégradés.
Il est important de noter que la PCR à sonde spécifique à l’allèle et les méthodes de séquençage de nouvelle génération ont montré une comparabilité de 99 % dans la détection des variantes virales. De plus, la méthode PCR à sonde allèle-spécifique a montré une sensibilité de 98 % et une spécificité de 100 % pour la variante alpha, une sensibilité de 90 % et une spécificité de 95 % pour la variante P1, et une sensibilité de 100 % et une spécificité de 91 % pour la variante P2.
Une analyse de régression probit a été menée pour prédire la fonctionnalité de la méthode de PCR par sonde spécifique à l’allèle sur un échantillon de population. Les résultats ont révélé que la méthode a la plus haute supériorité sur la méthode de séquençage de nouvelle génération pour détecter les variantes virales dans les échantillons avec des valeurs Ct comprises entre 26 et 30. La méthode PCR à sonde spécifique à l’allèle devait séquencer efficacement 96 % de ces échantillons, tandis que la méthode de séquençage de nouvelle génération ne devait séquencer que 30 à 40 % de ces échantillons.
Importance de l’étude
L’étude décrit le développement d’une méthode PCR de sonde spécifique à l’allèle qui est efficace à 99% en tant que méthodes de séquençage de nouvelle génération pour détecter les variantes virales dans les échantillons respiratoires. Il est important de noter que cette nouvelle méthode peut distinguer avec succès les variantes dans les échantillons avec un faible niveau d’ARN viral ou d’ARN viral dégradé. Un autre avantage est que la méthode peut être facilement modifiée pour cibler de nouveaux polymorphismes nucléotidiques uniques qui pourraient survenir dans le génome du SRAS-CoV-2 à l’avenir.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
