Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs ont utilisé diverses techniques de caractérisation analytique pour déterminer les attributs biophysiques du vaccin à acide ribonucléique (ARN) viral auto-amplificateur de l’Imperial College London (IMP-1) développé pour le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Sommaire
Arrière plan
Depuis le début de la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) fin 2019, la technologie des vaccins, en particulier le développement de vaccins à ARN messager, a considérablement progressé pour tenter d’atténuer la gravité et la transmission des infections par le SRAS-CoV-2.
Les vaccins à ARN auto-amplifiés (sa) sont une amélioration par rapport aux vaccins à ARNm, car le réplicon auto-amplifié permet à la machinerie de la cellule hôte de faire plusieurs copies de l’ARN de l’antigène cible. Bien que cela offre l’avantage d’administrer des doses de vaccin 10 à 100 fois plus faibles, le code d’auto-amplification rend le vaccin plus volumineux que les vaccins à ARNm ordinaires.
Les avantages des vaccins à ARN résident dans la facilité avec laquelle ils peuvent être conçus, fabriqués ou modifiés. Le processus de production du vaccin à ARNm comprend plusieurs étapes, à commencer par la in vitro transcription de la molécule d’ARN et progression vers la purification et l’encapsulation dans une nanoparticule lipidique. Chaque étape du processus implique divers réactifs et plusieurs sous-processus, et la plus petite erreur dans l’un de ceux-ci peut entraîner un vaccin inefficace ou incomplet.
Par conséquent, la caractérisation analytique et le contrôle qualité sont essentiels pour produire des vaccins à ARNm efficaces.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé la spectroscopie ultraviolette (UV), la diffusion biologique aux petits angles (BioSAXS), la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et le dichroïsme circulaire (CD) pour caractériser les attributs biophysiques de l’IMP-1. Ce vaccin saRNA comprend un code génétique pour la protéine de pointe SARS-CoV-2 stabilisée avant la fusion et une réplicase du virus de l’encéphalite équine vénézuélienne (VEEV).
L’ARNm d’IMP-1 a été transcrit in vitro, purifié et concentré par filtration tangentielle et chromatographie. La pureté et la concentration de l’ARNm IMP-1 ont été évaluées à l’aide de l’A260/280 Essai de spectrométrie UV. Le rapport entre les absorbances de 260 nm et 280 nm est utilisé pour déterminer la pureté de l’ARN, et des rapports inférieurs à deux indiquent une contamination protéique.
Les chercheurs ont ensuite effectué DLS, une technique de diffusion de la lumière basée sur une solution pour déterminer la polydispersité et la taille des molécules d’ARN dans un tampon de citrate de sodium ou de phosphate de sodium. L’ARN IMP-1 dans du citrate de sodium a également été utilisé dans les expériences BioSAXS pour déterminer la taille et la forme de l’ARN. BioSAXS est un processus à haut débit nécessitant de très faibles quantités d’échantillons purifiés et peut être réalisé à l’aide d’installations de rayons X ou de synchrotron à domicile hors ligne.
Enfin, un CD a été réalisé sur de l’ARN dans un tampon phosphate de sodium et de l’eau pour comprendre la structure et la chiralité ou la conformation de la molécule d’ARN. Les spectres CD ont été mesurés à l’aide d’un spectrophotomètre utilisant une gamme de longueurs d’onde de 320 nm à 180 nm.
Résultats
Les résultats ont indiqué que la molécule d’ARN IMP-1 comprend 11 551 paires de bases et pèse 3,71 MDa. La spectroscopie UV A260/280 le rapport était de 2,18, indiquant que l’ARN ne contenait aucun contaminant protéique.
Les expériences DLS et BioSAXS ont déterminé que le diamètre de la molécule d’ARN était de 873,63 Å. La méthode DLS a été réalisée sur deux tampons différents, et le diamètre moyen Z et l’indice de polydispersité (PDI) pour l’ARN étaient légèrement mais significativement différents pour les deux tampons, indiquant que le type de tampon, la force ionique et le pH influencent la taille de l’ARN.
Les spectres CD, qui révèlent les caractéristiques structurelles et conformationnelles de la molécule d’ARN, ont indiqué une hélice d’ARN de forme A droite et des interactions d’empilement dans la molécule d’ARN IMP-1. Les spectres des mesures utilisant de l’eau ont révélé un signal hélicoïdal plus petit, indiquant que, comme avec DLS, les résultats de CD dépendent du tampon. En tant que technique analytique, le CD est très utile pour observer l’effet du tampon, du pH, de la température, des dénaturants et des sels sur la structure et la conformation de l’ARN.
Les auteurs ont également discuté des défis liés à l’administration des molécules d’ARNm chargées négativement et à l’utilisation de l’encapsulation de nanoparticules lipidiques pour stabiliser et administrer efficacement le vaccin.
conclusion
Pour résumer, l’étude a exploré diverses techniques de caractérisation analytique pour étudier la pureté, la taille, la polydispersité, la structure et la conformation de la molécule d’ARNm IMP-1 transcrite à partir du plasmide portant le code génétique de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 et d’une réplicase VEEV .
Les techniques de spectrométrie UV, DLS, BioSAXS et CD explorées dans l’étude ont fourni des informations précieuses sur la concentration, la taille, la forme et la structure de la molécule d’ARN. L’étude a également mis en lumière les effets du tampon, du pH et de la force ionique sur la structure de l’ARN. Les auteurs pensent que des techniques supplémentaires telles que la calorimétrie à balayage différentiel et la diffusion de neutrons aux petits angles peuvent mieux comprendre la thermodynamique, la stabilité et la structure de la molécule d’ARN à des températures physiologiques pertinentes.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
