Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont développé un système tridimensionnel (3D) in vitro modèle tissulaire pour évaluer les effets du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) sur les cellules endothéliales vasculaires.
In vitro des modèles sont nécessaires pour améliorer la compréhension de la pathogénicité de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Précédemment, in vitro, des modèles tissulaires bidimensionnels (2D) pour étudier les impacts de l’infection par le SRAS-CoV-2 sur l’endothélium ont été développés avec une expression réduite de la molécule d’adhésion cellulaire, une perturbation de la barrière endothéliale et une sécrétion accrue de cytokines inflammatoires dans les cellules endothéliales. Cependant, en raison de l’impossibilité de simuler les réseaux vasculaires, les modèles 2D ne peuvent pas modéliser in vivo conditions aussi précisément que les modèles 3D.
Les auteurs de la présente étude ont précédemment utilisé des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) qui ont été différenciées en progéniteurs endothéliaux (EP) et encapsulées dans des structures d’hydrogel de collagène pour évaluer l’angiogenèse.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étendu leur analyse précédente en créant un modèle 3D pour étudier la perturbation du réseau vasculaire dans COVID-19.
Pour l’analyse, les hiPSC dérivés de fibroblastes de prépuce dermiques humains (DF19-19-9-11T) ont été cultivés et différenciés en hiPSC-EP. Par la suite, le cluster de différenciation (CD)34+ hiPSC–Les EP ont été isolés par analyse FACS (tri cellulaire activé par fluorescence) et le CD34+ hiPSC–Les cellules EP ont été encapsulées dans une structure d’hydrogel de collagène.
Les hydrogels encapsulés ont été cultivés pendant une semaine pour former des réseaux capillaires. Après cinq jours d’encapsulation, le CD34+-Les hydrogels de collagène chargés de hiPSC-EP ont été traités par la protéine de pointe (S) du SRAS-CoV-2 (CSP) pour simuler les infections par le SRAS-CoV-2. Des tests de libération de cytokines ont été effectués pour mesurer l’expression des cytokines inflammatoires après le traitement par CSP. Les réseaux de type vaisseau générés dans CD34+ iPSC–Les hydrogels de collagène chargés d’EP ont été visualisés par immunocytochimie.
Les cellules ont également été traitées avec de la dexaméthasone et visualisées par microscopie confocale. La longueur du vaisseau, la connectivité vasculaire et les diamètres de la lumière du vaisseau ont été analysés sur la base d’un pipeline de calcul développé précédemment. L’acide ribonucléique messager SARS-CoV-2 (ARNm) des hydrogels a été soumis à une analyse qRT-PCR (réaction en chaîne de la polymérase-transcription inverse quantitative) pour quantifier l’expression de l’ARNm en fonction des valeurs du seuil de cycle (Ct).
De plus, l’équipe a cherché à savoir si CD34+-les hiPSC formant des réseaux vasculaires au sein des hydrogels de collagène exprimaient l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2). De plus, l’expression de plusieurs gènes endothéliaux tels que KDR (récepteur de domaine d’insertion de kinase), CD31, CDH5 (cadhérine 5) et CD34 a été évaluée pour suivre la maturation endothéliale au cours de la période de culture d’une semaine et corréler les niveaux à l’expression d’ACE2.
Résultats
Le traitement avec CSP a considérablement réduit la proportion de cellules formant des vaisseaux et la connectivité du réseau de vaisseaux dans les EP dérivés de hiPSC encapsulés dans des hydrogels de collagène. Une expression élevée de cytokines inflammatoires a été observée conformément aux résultats cliniques, et un traitement à la dexaméthasone à 17 ng/mL a réduit le dysfonctionnement vasculaire dans les cellules traitées par CSP. Même en l’absence de cellules immunologiques, l’équipe a pu utiliser la 3D in vitro modèle d’angiogenèse pour simuler le dysfonctionnement induit par l’infection par le SRAS-CoV-2 des cellules endothéliales représentatives des présentations cliniques du COVID-19.
Après traitement CSP, le réseau vasculaire a montré une densité réduite et plus de cellules avec une morphologie arrondie altérée. Le traitement CSP (10 µg/mL) a entraîné des réductions de 22 %, 33 % et 29 % des paramètres vasculaires, des embranchements vasculaires et des liaisons vasculaires, respectivement. Les réductions correspondantes observées lors de l’utilisation de CSP à une concentration de 100 µg/mL étaient de 17 %, 24 % et 22 %, respectivement.
Une perte de connectivité du réseau vasculaire a été observée parmi les hydrogels de collagène traités au CSP avec une réduction de 77 % de la proportion de cellules faisant partie du plus grand réseau de vaisseaux. Lorsque le CSP a été ajouté le premier jour, des réductions de 19 % et 31 % ont été observées dans les points de ramification des vaisseaux et les fractions volumiques d’hydrogels de collagène comprenant des cellules qui forment des vaisseaux, respectivement. Les réductions correspondantes observées lorsque le CSP a été ajouté le cinquième jour étaient de 59 % et 66 %, respectivement, indiquant une toxicité plus élevée du CSP lorsqu’il a été ajouté le cinquième jour après le début de la formation des réseaux vasculaires.
L’expression de l’ACE2 était la plus élevée au jour 0 et réduite de 62 % en une semaine après le traitement par CSP. L’équipe a observé des réductions de 2,7 et 6,7 fois de l’expression de CD34 les premier et cinquième jours, respectivement. En revanche, l’expression de CD31 a été multipliée par deux, quatre et sept fois les jours 1, 5 et 7, respectivement, et l’expression de CDH5 a été multipliée par deux et trois les cinquième et septième jours, respectivement.
Le traitement par CSP a augmenté de manière significative la libération de l’interleukine-8 (IL-8) et du ligand du motif chimiokine CXC 1 (CXCL1) de deux et trois fois, respectivement. Les deux cytokines sont produites par les cellules endothéliales et sont régulées positivement dans le COVID-19. Les résultats ont indiqué que le traitement CSP a créé un état inflammatoire comparable à la tempête de cytokines documentée dans les cas graves de COVID-19.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré une reproduction réussie de la dysfonction endothéliale induite par le COVID-19 observée dans les milieux cliniques utilisant des hydrogels de collagène chargés de hiPSC-EP traités au CSP. Le traitement par CSP a provoqué une perturbation vasculaire significative, concernant les cellules du réseau vasculaire et la connectivité du réseau vasculaire, qui a été inhibée par la dexaméthasone.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
