Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont exploré les inhibiteurs des sphingosine kinases (SK) et caractérisé le rôle des SK dans l’entrée du virus Ebola (EBOV).
Les virus, tels que EBOV, qui envahissent les cellules hôtes par le biais de lysosomes ou d’endosomes tardifs sont appelés virus à pénétration tardive. Des facteurs hôtes tels que des molécules de signalisation sont requis par ces virus pour une fusion efficace avec les membranes des cellules hôtes, ce qui indique que des molécules de signalisation pourraient être développées en tant qu’agents antiviraux potentiels.
Les auteurs de la présente étude ont précédemment identifié plusieurs composés (n=35) qui inhibaient l’invasion de l’hôte par EBOV, dont le FTY-720 (fingolimod, 2-amino-2-(2-(4-octylphenyl)-ethyl)-1, 3-propanediol) et le PF-543 ont interféré avec la signalisation SK/S1PR (récepteur 1 de la sphingosine-1-phosphate), indiquant que les voies SK régulent l’entrée d’EBOV.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étudié le rôle des SK dans l’invasion de l’hôte par des virus à pénétration tardive tels que l’EBOV.
La régulation potentielle des voies SK/S1PR pour faciliter l’invasion de l’hôte par EBOV a été évaluée en caractérisant les activités antivirales des inhibiteurs de SK tels que FTY-720, SK1-I et PF-543. L’efficacité antivirale des trois inhibiteurs de SK a été confirmée en utilisant des particules de type filoviral (VLP) produites en co-exprimant VP40 (protéine de matrice EBOV) en fusion avec un rapporteur βlam (β-lactamase), la glycoprotéine (GP) d’intérêt et Nucléoprotéine EBOV (NP).
Les activités SK1 et SK2 ont été évaluées in vitro par analyse basée sur la protéine fluorescente verte (GFP) et expériences de culture cellulaire utilisant des cellules HT1080 (lignée cellulaire de fibrosarcome) transduites avec des pseudotypes de virus de la leucémie murine (MLV) EBOV GP et des cellules Vero. SK1 et SK2 ont été ciblés à l’aide d’acides ribonucléiques interférents courts (DsiARN) transfectés dans des cellules HT1080 et en utilisant des VLP hébergeant EBOV GP ou le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV)-G pour déterminer le rôle des SK dans l’entrée virale.
En outre, l’équipe a exploré si les inhibiteurs de SK diminuaient l’attachement d’EBOV aux cellules hôtes en utilisant des VLP d’EBOV par analyse de cytométrie en flux (FC). De plus, le blocage potentiel de l’internalisation virale par les inhibiteurs de SK a été évalué sur la base de l’absorption macropinocytaire d’EBOV. Les chercheurs ont exploré si les inhibiteurs de la SK empêchaient le clivage médié par la GP par les cathepsines en évaluant l’entrée des VLP clivées et non clivées dans les cellules HT1080 traitées au Ca074 (inhibiteur de la cathepsine B).
L’équipe a également évalué si les inhibiteurs de SK bloquaient le trafic endolysosomal viral vers NCP1 (récepteur EBOV) par analyse d’immunomarquage et la capacité des inhibiteurs de SK à bloquer les virus enveloppés en nécessitant des trafics endosomaux tels que le virus Junin (JUNV), le virus Marburg (MARV), la grippe A (IAV), le LFV et les coronavirus tels que les coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS), le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 1 (SARS-CoV-1) et le SARS-CoV-2.
Résultats
L’analyse par immunoblot a montré une expression significativement réduite de SK1 et SK2 lors de la transfection de cave avec leurs DsiARN correspondants. Les trois inhibiteurs de SK (FTY-720, SKI-I et PF-543) et l’inactivation de SK1,2 ont diminué l’entrée de VLP hébergeant EBOV GP. Pourtant, ils n’ont eu aucun impact sur les VLP hébergeant le VSV G, ce qui indique que les inhibiteurs de SK ciblaient l’entrée médiée par la GP d’EBOV.
Des vésicules intracellulaires dilatées ont été observées parmi les cellules traitées par FTY720 et SK1-I (mais pas les cellules traitées par PF-543, indiquant des défauts de trafic endosomal causés par les inhibiteurs de SK. En particulier, les inhibiteurs de SK ont bloqué le trafic endolysosomal EBOV VLP vers Niemann Pick C1 ( NPC1) indépendamment de la signalisation S1P via les récepteurs S1P (S1PR).
Les inhibiteurs de SK ont également empêché l’infection du SRAS CoV-2 dépendant des cathepsines et diminué l’entrée dans l’hôte d’autres virus à pénétration tardive tels que le SRAS-CoV-1, le SRAS-CoV-2, le MERS, le MARV, le JUNV et le virus de la fièvre de Lassa (LFV). Les composés antiviraux qui inhibaient SK1 ont démontré une puissance plus élevée, et les composés avec une faible inhibition de SK1 et> 40% d’activité résiduelle à une concentration d’inhibiteur de 1 μM ont montré une faible activité antivirale.
Une inhibition significative et complète de la réplication d’EBOV a été observée par le PF-543 à des concentrations de 5 µM et 10 µM, respectivement. Cependant, l’analyse FC a montré qu’aucun inhibiteur de SK ne réduisait la fluorescence des VLP, ce qui n’indique aucune inhibition significative de la fixation des VLP d’EBOV par les inhibiteurs de SK. De plus, FTY720 et SK1-I n’ont pas eu d’impact sur l’internalisation des VLP EBOV, le PF-543 n’a montré que des effets modestes et les inhibiteurs de SK ont montré une puissance égale pour inhiber l’entrée des VLP non clivées et clivées.
PF-543, internalisation légèrement réduite d’EBOV, indiquant que PF-543 a légèrement réduit l’internalisation d’EBOV. Tous les inhibiteurs de SK ont empêché le trafic d’EBOV vers les endosomes tardifs et/ou les lysosomes contenant NPC1, ce qui indique que les SK jouent un rôle essentiel dans le trafic endosomal. Le PF-543, un inhibiteur de la SK qui n’est pas un analogue de la sphingosine, n’induit pas la formation de vésicules dilatées ; il induit un défaut similaire de trafic endocytaire, expliquant le mécanisme de l’activité antivirale de nos inhibiteurs de SK.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que les SK étaient nécessaires pour le trafic endolysosomal tardif d’EBOV, mais pas pour l’attachement et l’internalisation d’EBOV et bloquaient l’infection par EBOV et d’autres virus à pénétration tardive. Les résultats ont mis en évidence le potentiel d’utilisation des inhibiteurs de la SK comme agents pan-antiviraux.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
