Test SARS-CoV-2 en 20 minutes avec FISH

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a entraîné plus de 181 millions d’infections confirmées et plus de 3,9 millions de décès dans le monde. Une pandémie de cette ampleur n’a pas été observée depuis la grippe espagnole de 1918.

Les défis qui ont surgi de la pandémie de coronavirus 2019 (COVID-19) ont illustré comment la dépendance de la normalité repose fortement sur une détection efficace des virus grâce à des tests efficaces.

Étant donné que le test RT-PCR de référence actuel présente des inconvénients tels que le fait qu’il prend du temps, le volume élevé de la demande peut être écrasant pour les laboratoires COVID-19. Cela illustre la nécessité de méthodes rapides, abordables et sensibles pour la détection des virus.

Une collaboration de l’Université d’Oxford et de l’Université de Warwick a conduit à la recherche d’une nouvelle méthode de détection virale par hybridation in situ en fluorescence rapide (FISH) afin de détecter efficacement le virus SARS-CoV-2 en 20 minutes.

Une version pré-imprimée du document est disponible sur le médRxiv* serveur, tandis que l’article est soumis à un examen par les pairs.

Tests SARS-CoV-2 actuels

Le test de diagnostic le plus couramment utilisé pour le virus COVID-19 qui est actuellement utilisé consiste en une amplification à base d’acide nucléique, une détection d’antigène et des tests sérologiques. Le test de réaction en chaîne par polymérase médiée par la transcriptase inverse (RT-PCR) est considéré comme l’étalon-or pour le test du SRAS-CoV-2.

Cependant, un test RT-PCR prend du temps et n’est effectué qu’en laboratoire, car la lyse virale et les procédures de purification de l’ARN sont nécessaires ainsi que la collecte, le transport et la réception des échantillons. Généralement, ces routines retardent les résultats des tests de 24 heures ou plus.

La pandémie de COVID-19 souligne les limites des tests RT-PCR

Alternatives aux tests RT-PCR

L’amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) est une alternative à la RT-PCR car elle permet de fournir des résultats après seulement une heure.

Il s’agit d’une différence significative par rapport à ce qui est requis des tests RT-PCR. Cependant, les tests RT-PCR et LAMP sont toujours limités par des problèmes de chaîne d’approvisionnement résultant des exigences coûteuses de production et de stockage des réactifs utilisés.

D’autres alternatives qui ont été développées pour les tests de détection rapide d’antigènes sont basées sur des dosages immunologiques et des formats de flux latéral afin de détecter rapidement le SRAS-CoV-2. Cependant, ces tests sont limités par leurs niveaux de sensibilité, ce qui diminue leur précision de détection.

Nouvelle méthode de test

L’hybridation in situ fluorescente, ou FISH, est une technique cytologique qui utilise la liaison sélective d’oligo- et polynucléotides marqués par fluorescence à des sections d’ADN et d’ARN complémentaires. Cela peut être dans des cellules et des tissus fixes pour la détection, la quantification et la localisation spatiale par microscopie à fluorescence.

Efficacité de la détection du virus dans un prélèvement de gorge. A) Des écouvillonnages nasaux et de gorge combinés ont été effectués conformément aux instructions de l’OMS [40]. Par la suite, les écouvillons de gorge ont été dilués dans une solution saline et enrichis avec la même concentration d’IBV (104 PFU/mL) dans chaque échantillon. Après une étape de centrifugation, les particules virales ont été immobilisées et colorées FISH comme décrit. B) Efficacité de la détection du virus dans les prélèvements de gorge par rapport au virus dilué avec une solution saline, en fonction du facteur de dilution. [+]: sondes IBV, [-]: sondes SARS-Cov-2, U : non dilué, barres d’erreur : SD de trois expériences indépendantes.

Habituellement, cette technique est utilisée pour détecter des anomalies chromosomiques et des réarrangements au sein de cellules fixes, telles que des traductions, des insertions et des suppressions. Il peut également être utilisé pour détecter des agents pathogènes dans les cellules, tels que des infections bactériennes et virales comme le VIH ou le virus d’Epstein-Barr.

L’ARN FISH peut également être utilisé pour visualiser la transcription génique in situ ; en augmentant le nombre de fluorophores qui se lient à un transcrit d’ARN, il est possible de détecter des transcrits uniques – ce processus a conduit à la technique FISH à molécule unique (smFISH). Grâce à l’utilisation de smFISH, des molécules d’ARN viral uniques peuvent être détectées et identifiées sans nécessiter d’amplification enzymatique.

Les chercheurs de cette étude ont introduit une technique FISH virale rapide (rvFISH) pour la détection de particules virales, qui dépendait de l’analyse systémique de la réaction d’hybridation ; les chercheurs ont pu analyser l’efficacité des réactions d’hybridation tout en réduisant les étapes de la procédure ainsi que le temps pris. Cette technique a permis la détection de particules grippales et d’un coronavirus aviaire, le virus de la bronchite infectieuse (IBV), en un temps de dosage de 20 minutes.

Cette technique a également permis de détecter les particules de SRAS-CoV-2 inactivées de la même manière ainsi que de détecter les particules virales à partir d’écouvillons nasopharyngés. Ceci est important car il illustre la sensibilité de la technique, qui serait utile pour détecter le SARS-CoV-2 de manière efficace et plus efficace.

Grâce à l’utilisation d’une stratégie de double marquage, l’arrière-plan résultant de points fluorescents lumineux mal identifiés a pu être supprimé. Cela a en outre confirmé l’application de smFISH en tant que technique possible pour détecter et quantifier rapidement et facilement les souches virales, ce qui profiterait à la pandémie de COVID-19.

Une limitation explorée dans l’étude comprenait l’exigence d’un microscope à fluorescence, les chercheurs utilisant un instrument commercial pour détecter la fluorescence à partir de molécules uniques afin de calibrer la limite de détection des particules virales. Cependant, en raison des particules plus brillantes telles que les billes fluorescentes utilisées pour cet étalonnage, la détection d’une seule molécule n’est pas nécessaire. Les particules virales devraient pouvoir être détectées par des microscopes moins sensibles.

La recherche de ce document pré-imprimé fournit une base bénéfique et efficace pour développer une nouvelle méthode de test pour le SRAS-CoV-2, qui pourrait être plus fiable et efficace en raison de la forte dépendance aux tests pendant cette pandémie.

rvFISH peut être un outil polyvalent pour étudier l’hybridation d’oligonucléotides à des particules virales et éventuellement être une alternative ou un complément à l’utilisation de tests RT-PCR ; cela peut alléger le fardeau de ce test actuel et accélérer le processus qui en résulte, ce qui peut aider à un semblant de normalité pendant la pandémie de COVID-19.

*Avis important

medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.