Un test triplex SARS-CoV-2 basé sur le séquençage des nanopores est précis, rapide et évolutif

Une nouvelle percée par un groupe de recherche d'Oxford Nanopore Technologies est un moyen rapide de tester et de cribler un grand nombre d'échantillons pour le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Ce test, connu sous le nom de LamPORE, est décrit dans l'article actuellement disponible sur le medRxiv * serveur de préimpression et combine une amplification multi-cible à code-barres, une préparation de bibliothèque de codes-barres en 15 minutes et un séquençage de nanopores en temps réel.

Micrographie électronique à balayage colorisée d'une cellule fortement infectée par des particules virales du SRAS-CoV-2 (jaune), isolée à partir d'un échantillon de patient. La zone noire de l'image est un espace extracellulaire entre les cellules. Image prise au centre de recherche intégré (IRF) du NIAID à Fort Detrick, Maryland. Crédit: NIAID

Bien qu'en janvier 2020, la maladie à coronavirus (COVID-19) n'était toujours pas une menace pandémique à laquelle nous sommes actuellement confrontés; la première séquence génomique du SRAS-CoV-2 a déjà été publiée, permettant à son tour le développement de tests évaluant la présence d'ARN viral dans des échantillons biologiques. Cela a rapidement fourni un moyen d'identifier les personnes actuellement infectées par le virus.

Il n'y a pas de consensus sur la façon dont les personnes asymptomatiques infectieuses sont. Pourtant, il ne fait aucun doute que de nombreuses personnes peuvent transmettre le virus avant de développer des symptômes ou si leur présentation clinique est légère. Par conséquent, le dépistage systématique de grandes parties de la population à mesure que la pandémie se propage devient une nécessité.

Un trio de méthodes

LAMP est une technique bien établie utilisant une amplification isotherme ciblée qui génère des microgrammes de produit à partir de dizaines de copies de la région cible – le tout en 30 minutes à 65 ° C. Cependant, la précision est entravée par la mesure indirecte (c.-à-d., Changements de couleur fluorescente ou augmentation de la turbidité).

À l'inverse, les techniques de séquençage fournissent des résultats précis, ainsi qu'une opportunité d'amplifier et de détecter plusieurs cibles en une seule réaction. Pendant le séquençage des nanopores, un courant électrique est calculé lorsque les brins du modèle traversent chaque pore du réseau de cellules à écoulement, ce qui permet l'analyse des données en temps réel.

Le kit de préparation rapide de bibliothèques de codes-barres d'Oxford Nanopore Technologies (ONT) utilise une transposase pour convertir l'ADN en une bibliothèque de codes-barres qui peut être séquencée en 15 minutes environ, avec 96 codes-barres disponibles. Cela permet aux échantillons préparés d'être regroupés pour le séquençage. Toutes ces techniques peuvent-elles être combinées pour augmenter la sensibilité et la spécificité?

Dans ce manuscrit, les chercheurs d'Oxford Nanopore Technologies ont démontré une méthode qui combine en effet l'amplification rapide spécifique à la cible fournie par LAMP, une méthode de préparation de bibliothèque basée sur la transposase, et le séquençage et l'analyse des données des nanopores en temps réel. Cette méthode est également connue sous le nom de test triplex SARS-CoV-2 ou LamPORE.

Vue d'ensemble du flux de travail du laboratoire LamPORE

Optimiser les performances des tests

Pour préparer le test LamPORE, les chercheurs ont choisi de cibler trois régions différentes du génome du SRAS-CoV-2 dans une seule réaction multiplexée. Il s'agit des gènes ORF1a, d'enveloppe (E) et de nucléocapside (N), avec des ensembles d'amorces AS1, E1 et N2, respectivement.

Pour contrôler la qualité de la préparation des échantillons, de l'extraction de l'ARN, de la transcription inverse et de l'amplification LAMP, les scientifiques ont inclus un ensemble d'amorces afin d'amplifier l'ARN messager de l'actine humaine. Ces derniers doivent être présents dans tous les échantillons sur écouvillon (quel que soit leur statut SARS-CoV-2); par conséquent, cela peut faire la différence entre les vrais négatifs et les échantillons invalides.

En outre, pour évaluer l'inclusivité du test triplex SARS-CoV-2 proposé, ils ont aligné toutes les séquences d'amorces sur les 46872 génomes humains du SRAS-CoV-2 déposés au GISAID (au 16 juin 2020). La présence d'une seule discordance n'influencera probablement pas la limite de détection.

Des courbes de caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) ont été générées pour la somme des comptages de lecture SARS-CoV-2, ainsi que pour les comptages de lecture de chaque cible SARS-CoV-2. La somme des décomptes de lecture sur chacune des trois cibles SARS-CoV-2 (AS1, E1 et N2) a servi de métrique de notation pour décider si les résultats sont positifs, négatifs, non concluants ou invalides.

Pour élargir l'évaluation des performances du test, les chercheurs ont obtenu quatre-vingts échantillons cliniques positifs pour l'ARN du SRAS-CoV-2 par RT-qPCR, qui avaient été extraits de prélèvements nasopharyngés d'individus infectés.

Résultats rapides et précis avec une évolutivité élevée

Dans cette étude, les chercheurs ont montré qu'une réaction d'amplification multiplexée où trois régions distinctes du génome du SRAS-CoV-2 sont ciblées se traduit par des performances de haute sensibilité, hautement comparables à la réaction en chaîne par transcription inverse-polymérase (RT-qPCR).

En commençant par l'ARN extrait, les résultats peuvent être obtenus à partir de 12 échantillons en environ une heure, et de 96 échantillons en moins de 2 heures. De plus, une évolutivité élevée est facilement obtenue par codage à barres combinatoire, et les quantités de matrice variaient de 20 à 250 copies par réaction.

Sur les 80 positifs vérifiés par RT-qPCR, 79 ont été qualifiés de positifs dans l'analyse LamPORE. Le faux négatif correspondait à l'échantillon avec la charge virale la plus faible (selon la valeur de quantification du cycle obtenue par PCR).

De plus grands degrés de multiplexage

En bref, ce nouveau test est simple à mettre à l'échelle de petits nombres d'échantillons à des milliers, avec des degrés plus élevés de multiplexage qui est réalisable en augmentant le nombre de codes à barres, ainsi qu'avec l'utilisation de codes à barres combinatoires.

«LamPORE s'appuie sur le séquençage, par opposition à un changement de couleur, ce qui soulève la possibilité d'utiliser une seule réaction LamPORE multiplexée pour détecter de nombreux pathogènes différents», soulignent les auteurs de l'étude dans leur medRxiv papier.

En cas de co-infections, ce test doit également identifier la combinaison exacte d'agents pathogènes présents dans l'échantillon. Les caractéristiques de performance sont actuellement en cours d'établissement et l'autorisation réglementaire de mise sur le marché est en cours, ce qui est une nouvelle encourageante dans notre lutte contre la pandémie de COVID-19.

*Avis important

medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.