Dans une étude récente publiée dans Biotechnologie naturelleles chercheurs ont développé un pipeline de séquençage du génome entier (WGS) basé sur la technologie des nanopores pour l’identification rapide des variants génétiques.
Contexte
WGS a bénéficié aux patients gravement malades en permettant l’identification des causes génétiques des infections. Cependant, le temps nécessaire au WGS empêche son utilisation dans les infections aiguës. Bien que le délai d’exécution standard du WGS soit de plusieurs semaines, des études ont rapporté une réduction du délai d’exécution à quelques jours pour les nouveau-nés, le délai le plus rapide étant de 14,3 heures.
Les auteurs de la présente étude ont émis l’hypothèse que leur plate-forme PromethION (Oxford Nanopore Technology) pourrait encore réduire le temps WGS et permettre l’appel de base, l’alignement, l’appel de variantes et la filtration de variantes en temps réel.
À propos de l’étude et des résultats
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un pipeline WGS à nanopores et ont rapporté ses caractéristiques et son efficacité clinique dans l’identification rapide des variants génétiques responsables.
Le pipeline nanopore WGS a été conçu pour surmonter les lacunes des approches WGS précédemment utilisées. Le pipeline a utilisé un protocole optimisé pour la préparation des échantillons, la distribution des séquences sur 48 Flow Cells, une qualité d’acide désoxyribonucléique (ADN) maximisée avec un temps de préparation réduit et des méthodes de calcul telles que Google Cloud et l’accélération de l’unité de traitement graphique (GPU), ainsi que plusieurs logiciels et pipelines. avec séquence parallèle.
De plus, l’appel des variantes a été accéléré et la vitesse de filtrage des variantes a été augmentée. Ces improvisations ont réduit le temps d’exécution global, activé l’appel et l’alignement de base en temps quasi réel, amélioré l’appel de variantes et accéléré la filtration des variantes pour permettre un diagnostic WGS rapide. Les improvisations du pipeline ont été décrites à l’aide de l’échantillon Genome in A Bottle (GIAB) HG002 dans la présente étude.
Tout d’abord, le protocole standard de préparation d’échantillons a été utilisé pour distribuer des bibliothèques d’échantillons sur 48 Flow Cells. Pour améliorer la qualité de l’ADN obtenu à partir de petits volumes de sang, le protocole d’extraction d’ADN a été adapté et par la suite, un rendement de 36 μg d’ADN de poids moléculaire élevé et > 60 kb a été obtenu à partir de 1,6 ml de sang en 50 minutes.
Pour réduire le temps de préparation de la bibliothèque, la quantité d’ADN d’entrée a été augmentée à 4 μg pour chaque réaction (à partir de 1 μg) et huit réactions ont été exécutées en parallèle (plutôt que séquentielles). Cette approche a donné une bibliothèque génétique optimale de 16 μg, ce qui a permis de charger 333 ng de la bibliothèque dans chaque Flow Cell. De plus, les auteurs n’ont pas utilisé d’échantillon de code-barres, ce qui a réduit le temps de préparation de la bibliothèque de 37 minutes.
Pour rendre le pipeline rentable, les cellules ont été réutilisées pour plusieurs échantillons en retirant l’ADN des échantillons par des lavages à la nucléase après chaque analyse. Le taux maximal de transfert d’ADN était de 0,4 %. Lors d’une validation plus poussée, le transfert maximal tolérable entre les échantillons était de 1 %.
Pour effectuer un appel et un alignement de base en temps quasi réel, le logiciel Guppy et le logiciel Minimap2 ont été utilisés, respectivement, avec une profondeur d’échantillon HG002 de 218 Go. Cependant, même en appliquant un débit maximal (2,5 Gbmin−1), un temps système de 18,5 heures pour l’appel de base et le post-séquencement d’alignement serait observé. Ainsi, des méthodes de calcul, telles que Google Cloud et l’appel de base parallélisé et l’alignement sur plusieurs unités de traitement graphique (GPU) avec des fichiers de type fast5 compressés, ont été utilisées.
De plus, le modèle de téléchargement périodique a été utilisé dans lequel les données brutes ont été distribuées sur 16 instances de calcul fonctionnant en parallèle, chacune exécutant les logiciels Guppy et Minimap2 pour trois cellules de flux par instance. Cela a réduit le temps de surcharge à 25 minutes.
Pour améliorer l’appel de variantes, l’équipe a utilisé deux pipelines-PEPPER-Margin-DeepVariant et Sniffles pour identifier les longues lectures de petites variantes et de variantes structurelles (SV), respectivement. Le temps d’exécution a été réduit à 29 minutes grâce à l’utilisation parallèle des pipelines DeepVariant et Sniffles sur 14 GPU et deux unités centrales de traitement (CPU), respectivement. Le temps d’exécution a encore diminué à 23 minutes en intégrant le logiciel NVIDIA Parabricks et le pipeline DeepVariant.
Pour améliorer la précision de la détection des insertions et suppressions génétiques (indel), l’équipe a modifié les images générées par le logiciel DeepVariant pour incorporer le réalignement des lectures en fonction de la présence d’allèles alternatifs pour chaque événement indel. Cela a non seulement amélioré la détection des indels, mais également réduit le temps de curation nécessaire à l’évaluation des variantes.
Pour améliorer l’efficacité de la filtration des variantes, l’équipe a développé un schéma d’arbre de classification personnalisé basé sur la classification du Stanford Clinical Genomics Program (GCP). Plusieurs critères ont été appliqués en fonction du phénotype du patient et des annotations de variantes et ont été notés indépendamment. Seules les variantes hautement prioritaires avec des scores totaux ≥ 4 ont été examinées manuellement. Dans l’échantillon HG002, cette méthode de filtrage des variantes a réduit le nombre de variantes prioritaires de 101 à 20, réduisant ainsi la liste des variantes causales probables de la maladie génétique.
L’équipe a appliqué le pipeline nanopore WGS à deux cas : un patient de 57 ans atteint de COVID-19 sévère et une fillette de 14 mois en soins intensifs après une insuffisance respiratoire et un arrêt cardiaque, dans lesquels le pipeline a identifié des variantes de le gène TNNT2 et le gène LZTR1 comme variantes causales probables, respectivement, dans les huit heures suivant le prélèvement sanguin.
conclusion
Pour résumer, les résultats de l’étude ont montré que le pipeline WGS nanopore a fourni des données WGS humaines en deux heures et identifié des variants génétiques responsables en huit heures. Cela indique une amélioration d’environ 50 % par rapport au temps WGS le plus rapide signalé à ce jour.
