Dans une étude récente publiée dans le Journal international des sciences moléculairesles chercheurs ont identifié des médicaments inhibant l’entrée du coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Arrière-plan
Le SRAS-CoV-2 pénètre dans les cellules hôtes en se fixant au récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) par l’intermédiaire de sa protéine de pointe (S). Le blocage des interactions entre l’ACE2 et la protéine S est essentiel pour inhiber l’infection. La vaccination contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a été (principalement) efficace pour limiter l’épidémie d’infection. Néanmoins, plusieurs variantes préoccupantes (COV) ont émergé, présentant une résistance significative à l’immunité induite par le vaccin ou l’infection. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer des médicaments à large spectre qui inhibent la souche de type sauvage et les variantes mutantes du SRAS-CoV-2.
L’étude et les conclusions
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un test pour détecter les interactions moléculaires entre le domaine de liaison au récepteur de la protéine S (RBD) et le récepteur ACE2. Une bibliothèque de médicaments a été examinée pour identifier les inhibiteurs potentiels (d’entrée).
Les auteurs ont utilisé la technologie de complémentation protéique, c’est-à-dire la technologie binaire NanoLuc (NanoBiT), pour développer le test de fixation ACE2-RBD. L’ACE2 humain a été fusionné avec la sous-unité Small BiT (SmBiT) de la luciférase NanoLuc, transfectée dans des cellules HeLa, et une lignée cellulaire HeLa stable exprimant SmBiT-ACE2 a été établie. Par la suite, cinq grandes constructions de fusion de sous-unités BiT (LgBiT)-RBD ou S1 ont été générées.
Les produits de fusion recombinants (LgBiT-RBD, LgBiT-S1) ont été incubés avec les cellules exprimant SmBiT-ACE2. Aucune luminescence n’a été détectée avec les constructions de fusion LgBiT-RBD, LgBiT-S1 et S1-LgBiT, tandis qu’un signal de luminescence robuste a été observé pour la construction RBD-LgBiT. Une autre construction (de fusion) avec un lieur entre RBD et LgBiT (RBD-linker-LgBiT) n’a eu aucune amélioration notable de l’activité de la luciférase, et des expériences ultérieures ont été réalisées à l’aide de la construction RBD-LgBiT.
Ensuite, une bibliothèque de médicaments approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) a été examinée pour identifier les candidats-médicaments potentiels ayant des effets inhibiteurs sur la fixation du SARS-CoV-2 RBD. Sur les 1068 médicaments, 16 ont démontré une inhibition de la fixation RBD de plus de 50 %. Le dépistage négatif des 20 meilleurs médicaments ayant l’activité inhibitrice la plus élevée à l’aide du test HiBiT-NanoLuc a éliminé 11 candidats d’une analyse plus approfondie. Les neuf candidats étaient l’aripiprazole, l’ABT-199, le dolutégravir sodique, l’étravirine, la gramicidine, l’ivermectine, le miconazole, le nitrate de miconazole et l’ospémifène.
Un test cytotoxique a été effectué sur des cellules VeroE6 en utilisant ces (neuf) candidats, et seuls trois : le dolutégravir, l’étravirine et le sspemifène, étaient non toxiques. En outre, les médicaments candidats ont été soumis au test d’attachement RBD-ACE2, qui a révélé que l’étravirine était la plus efficace, avec une concentration efficace demi-maximale (EC50) de 2,3 µM. L’ivermectine qui inhibe la réplication du SRAS-CoV-2 dans les cultures cellulaires a présenté une faible CE50 de 22,8 µM.
Des pseudovirus avec la protéine S du SRAS-CoV-2 et le gène rapporteur NanoLuc ont été produits. Les cellules SmBiT-ACE2 ont été incubées avec un pseudovirus et des inhibiteurs candidats pendant six heures, suivies de l’élimination du pseudovirus et d’une incubation continue pendant 16 heures. Le dolutégravir et l’étravirine ont neutralisé les pseudovirus de type S avec EC50 valeurs de 40 nM et 5,8 nM, respectivement. L’efficacité de neutralisation des candidats a été déterminée à l’aide du test de neutralisation par réduction de plaque (PRNT).
Le (authentique) SARS-CoV-2 a été pré-incubé avec les médicaments candidats avant d’infecter les cellules VeroE6. La neutralisation a été estimée en quantifiant les plaques cinq jours après l’infection (dpi). Le dolutégravir a neutralisé l’infection par le SRAS-CoV-2 avec un CE50 de 4,2 µM et l’étravirine à 7,7 µM, alors que l’ivermectine a inhibé 60 % de l’infection ; les auteurs ont supposé que le résultat aurait pu être biaisé en raison de sa cytotoxicité.
L’amarrage moléculaire du dolutégravir, de l’étravirine et de l’ivermectine sur S RBD et ACE2 a été effectué. Avec l’amarrage des inhibiteurs de l’ACE2, les sites de liaison prédictifs n’étaient pas à l’interphase d’interaction RBD, ce qui indique qu’il ne s’agissait pas de la cible principale des inhibiteurs. Sans surprise, une haute affinité a été détectée entre S RBD et les inhibiteurs à l’interphase de la protéine ACE2-S. Le score d’affinité moyen du dolutégravir pour le RBD était de -7,52 kilocalories par mole (kcal/mol) et de -7,8 kcal/mol pour l’étravirine.
De plus, lorsque S RBD hébergeant la substitution N501Y a été testé, les résultats d’amarrage n’ont pas été affectés. Les chercheurs ont étudié le potentiel de neutralisation du Dolutegravir et de l’Etravirine contre les pseudovirus porteurs de la protéine S des COV Alpha, Beta, Delta ou Omicron. Aucun changement significatif n’a été noté dans la CE50 valeurs des deux médicaments contre les COV du SRAS-CoV-2. Il convient de noter la neutralisation très puissante du COV d’Omicron par les deux médicaments.
conclusion
L’équipe de recherche a identifié deux médicaments puissants pour inhiber l’entrée du SRAS-CoV-2 dans les cellules hôtes. Dans l’ensemble, l’attachement RBD-ACE2 développé par les chercheurs est robuste et offre des résultats d’attachement en seulement 10 minutes sans avoir besoin d’installations de niveau de biosécurité (BSL)-2. Les deux médicaments étaient efficaces et inhibaient les virus de type sauvage et les variants mutants. Étant donné que les médicaments peuvent être administrés par voie orale, les auteurs postulent leur utilisation comme traitement prophylactique au COVID-19 pré ou post-exposition.
