Pour lutter contre la pandémie mondiale de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), des vaccinations et des procédures de traitement ont été développées à un rythme effréné. Cependant, le SRAS-CoV-2 continue de muter et de s’adapter à la population humaine, ce qui nécessite un examen de l’efficacité des contre-mesures médicales actuelles ou le développement de nouvelles à court et à long terme. Les efforts pour voir si les vaccinations SARS-CoV-2 de première génération sont efficaces contre la forme Delta hautement transmissible l’ont mis en évidence.
Toutes les premières souches du SRAS-CoV-2 ont été cultivées sur des lignées cellulaires African Green Monkey Vero. Les cellules Vero prolifèrent rapidement et expriment des niveaux élevés d’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2), une molécule reconnue par le RBD (domaine de liaison au récepteur) de la protéine de pointe utilisée par le SRAS-CoV-2 pour pénétrer dans les cellules épithéliales pulmonaires. La pré-activation médiée par la furine de la protéine de pointe améliore l’entrée virale via le récepteur ACE2. Le SARS-CoV-2, en revanche, peut pénétrer dans les cellules Vero par endocytose, rendant inutile l’utilisation du récepteur ACE2.
Plusieurs études ont découvert que la propagation du SRAS-CoV-2 sur des lignées cellulaires dérivées de Vero entraînait l’accumulation et la perte rapides d’un site de clivage fonctionnel de la furine en quelques passages. En conséquence, la propagation du SRAS-CoV-2 sur des cellules Vero a produit des stocks de provocation avec des défauts dans le site de clivage de la furine, les rendant non pathogènes chez les animaux.
Les auteurs d’une nouvelle étude, publiée dans la revue Virus, a examiné comment la propagation d’un isolat du SRAS-CoV-2 lié à B.1.351 (variante bêta) dans deux types de cellules, les cellules Vero/hSLAM et Calu-3, a affecté les séquences du génome viral à la fois à l’intérieur et à l’extérieur de la furine du gène de pointe site de clivage. Lorsque le virus a été cultivé sur des cellules Vero/hSLAM, les auteurs ont observé une expansion des mutations dans le site de clivage de la furine, mais celles-ci ont été éliminées lorsqu’il a été cultivé sur des cellules Calu-3. De plus, des variantes distinctes qui se sont accumulées lorsque ce stock de virus a été cultivé sur des cellules Calu-3 ont également été découvertes. Notamment, les stocks de virus dérivés de Calu-3 sont restés pathogènes chez les hamsters, tout comme les variantes spécifiques de Calu-3. Ces résultats soutiennent la croissance des stocks de provocation SARS-CoV-2 sur des cellules Calu-3 avant utilisation chez les animaux afin de maintenir un site de clivage de la furine intact et une pathogénicité virale.
L’étude
Des conditions appropriées de propagation du virus sont nécessaires pour maintenir le site de clivage de la furine intact dans les populations de virus SARS-CoV-2. Les auteurs voulaient voir si la propagation d’une lignée B.1.351 du SRAS-CoV-2 sur des cellules Calu-3 aboutirait à un stock de virus exempt de mutations et de délétions au site de clivage de la furine, même si le stock avait déjà été passé deux fois sur des cellules Vero. . Les auteurs voulaient voir si la propagation de virus sur des cellules Calu-3 éliminerait les sous-populations virales accumulées avec des séquences de sites de clivage de furine mutantes et empêcherait la génération de virus avec de nouvelles variantes ou des délétions de ce site en raison des adaptations de la culture cellulaire.
Le même isolat p3 d’une lignée virale B.1.351 qui avait été passé deux fois à travers des cellules Vero E6 a été obtenu par deux laboratoires différents (BEI Resources et BIOQUAL). Les mutations précédemment accumulées dans le site de clivage de la furine ont été perdues de la population lorsqu’elles ont été cultivées indépendamment sur des cellules Calu-3 à chaque site.
D’autre part, BEI Resources a cultivé le même stock sur des cellules Vero-hSLAM et a découvert que les mutations du site de clivage de la furine survivaient dans la population. Ces résultats correspondent à des recherches récentes qui ont utilisé des cellules Calu-3 pour cultiver un isolat précoce du SRAS-CoV-2 et produire des variantes de pseudovirus. Les virus du SRAS-CoV-2 avec un site de clivage de la furine non endommagé ont infecté les cellules Calu-3 plus rapidement dans chacune de ces enquêtes.
Les auteurs ont développé cette découverte en découvrant que lorsque des variantes B.1.351 « Beta » du SRAS-CoV-2 avec des mutations ponctuelles du site de clivage de la furine se sont propagées sur des cellules Calu-3, elles ont également été perdues de la population. Cette découverte suggère que lorsqu’elles sont cultivées sur des cellules Vero, toutes les variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 recueilleront des altérations du site de clivage de la furine, mais que celles-ci peuvent être éradiquées si elles sont produites sur Calu-3 avant d’être utilisées chez les animaux.
Les chercheurs ont infecté quatre hamsters avec la souche BQ-RSA-p4 dérivée de Calu-3 pour voir si les mutations spécifiques de Calu-3 survivraient in vivo. Chez ces animaux, le virus s’est bien développé, avec des titres viraux subgénomiques dépassant 107 copies/gramme de tissu pulmonaire, similaires aux résultats montrés chez les hamsters infectés par l’isolat WA/2020 (Wuhan). Les hamsters ont perdu environ 15 % de leur poids corporel, ce qui indique que les mutations liées à Calu-3 ont eu peu d’effet sur la pathogénicité du virus chez les hamsters.
En comparaison, les hamsters infectés par des souches sans site de clivage de la furine n’ont perdu qu’une petite quantité de poids. Les variations trouvées dans les souches dérivées de Calu-3 chez les hamsters ont été soit conservées, soit étendues. Les recherches futures devront voir si d’autres variantes de la lignée SARS-CoV-2 (telles que B.1.617.2) acquièrent les mêmes variantes nucléotidiques lorsqu’elles sont cultivées sur des cellules Calu-3 ou si les variantes nucléotidiques décrites ici ne se trouvent que dans le B. 1.351 lignée.
Implications
Ces résultats confirment un processus dans lequel le séquençage complet d’un inoculum d’épreuve est nécessaire pour obtenir une image complète de la complexité de la population virale. Les fréquences des variantes continueront de changer à mesure que les stocks de défi SARS-CoV-2 s’adapteront aux paramètres de culture cellulaire car ils se propagent régulièrement à plusieurs endroits. Il est crucial de savoir si une variation virale pathogène trouvée chez un animal est sortie de zéro ou si elle était déjà présente dans l’inoculum. En conséquence, l’étude de la diversité virale au-delà de la séquence consensus est essentielle pour identifier les changements sous-jacents qui pourraient modifier la pathogénicité du virus. À partir de ces résultats, il pourrait être suggéré que chaque étude de provocation in vivo devrait inclure une caractérisation de la complexité du stock de provocation.
