La maladie COVID-19 commence par une infection respiratoire, dans la cavité nasale, avec une réplication virale du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère qui se poursuit dans l'épithélium nasal pendant des jours et finit par se propager vers le bas pour impliquer les voies respiratoires inférieures. Les scientifiques se demandent donc si l'administration d'un inhibiteur viral dans le nez et le système respiratoire fonctionnerait bien pour prévenir l'infection ou pour traiter une infection précoce par le SRAS-CoV-2. Dans ce cas, un tel médicament serait utile pour traiter les agents de santé et autres personnes à haut risque.
Sommaire
Mini-liants vs anticorps
Maintenant, une nouvelle étude publiée sur le serveur de pré-impression bioRxiv * en août 2020 rapporte le développement de mini-inhibiteurs basés sur une conception informatique, qui sont adaptés à une telle utilisation topique. Ceux-ci seraient supérieurs aux anticorps monoclonaux actuellement disponibles car ils sont suffisamment petits pour être administrés par voie intranasale, contrairement aux anticorps maladroits, qui sont instables. De plus, les anticorps se lient au virus en seulement deux sites pour une molécule de 150 KDa et provoquent parfois une augmentation de la maladie dépendant des anticorps plutôt qu'une protection.
Les nouvelles molécules sont de petits composés stables qui se lient à la protéine de pointe à haute affinité. Puisqu'ils sont capables de se lier à plusieurs domaines, ils permettent à la densité des domaines inhibiteurs d'être maximale. Ainsi, ils peuvent être instillés par voie intranasale, ou administrés par nébulisation ou sous forme d'aérosol de poudre sèche, empêchant la protéine de pointe virale de se lier au récepteur ACE2 hôte.
L'étude reprend les résultats d'une précédente étude sur la grippe dans laquelle de petites protéines similaires conçues pour des interactions étroites avec l'hémagglutinine du virus de la grippe ont pu à la fois prévenir et traiter la grippe mortelle dans des modèles expérimentaux de rongeurs.
Deux approches de la conception de minibinder
Les chercheurs visaient à créer de telles molécules de mini-liant avec une forte affinité pour le domaine de liaison au récepteur de pointe (RBD) afin d'inhiber la liaison de l'ACE2 de manière compétitive. Ils ont suivi deux directions: l'une était basée sur des échafaudages construits autour de l'hélice alpha de la protéine ACE2 qui est responsable de la plupart des interactions avec la RBD, en l'incorporant dans de petites protéines conçues pour avoir plus de sites de liaison pour la RBD et donc avoir une affinité accrue.
La deuxième approche consistait à concevoir des mini-liants de novo indépendamment des interactions identifiées avec le RBD, afin d'explorer une gamme beaucoup plus large de structures potentielles avec beaucoup plus de modes de liaison à haute affinité avec les régions RBD autour du site de liaison au Récepteur ACE2. Cela empêcherait théoriquement l'échappement mutationnel du virus de la neutralisation.
Trouver des candidats prometteurs
Ils ont proposé trois modèles et 105 modèles par les première et deuxième approches, respectivement. Ceux-ci ont été incorporés dans de longs oligonucléotides, qui ont été examinés pour leur liaison à la RBD sur la surface des cellules de levure, marqués avec un colorant fluorescent pour une identification facile de la liaison mini-liant-RBD. Tous les trois premiers et 12 du deuxième type de conception ont été codés et exprimés par E. coli pour mesurer l'affinité de liaison.
Les chercheurs ont trouvé une affinité de liaison d'environ 2 uM et de 100 nM à 2 uM avec l'un des modèles à base d'hélice alpha et 11 des conceptions de novo, respectivement. Le raffinage médié par la mutagenèse de la première conception basée sur ACE2 a produit un variant avec une affinité encore plus élevée d'environ 1 nM, inhibant la liaison ACE2-RBD.
Un raffinage supplémentaire basé sur la mutagenèse du deuxième type de mini-liants a montré que 40 des 50 composés ainsi raffinés présentaient une conservation élevée des acides aminés à la fois au site de liaison et au cœur de la protéine. Lorsque les substitutions les plus courantes ont été construites dans des bibliothèques pour le criblage de liaison par affinité à des concentrations décroissantes, les chercheurs ont trouvé un petit nombre de séquences étroitement liées. Lorsqu'une de chaque séquence a été sélectionnée pour chaque conception, ils ont constaté que ce sous-ensemble final présentait une liaison de haute affinité pour le RBD de manière compétitive avec ACE2.
Enfin, les chercheurs ont exprimé ces molécules LCB1-LCB8 dans E. coli et mesuré leur affinité pour le RBD. Ils ont constaté que l'affinité de liaison variait de moins de 1 nM à 20 nM. En fait, deux d'entre eux avaient une affinité trop forte pour un dosage fiable avec la technique utilisée. Ces deux, LCB2 et LCB3 se sont liés à des concentrations picomolaires de RBD. Ceux-ci se sont révélés stables et conservaient l'activité de liaison d'origine après être restés à température ambiante pendant 2 semaines. Cela peut éviter l'exigence d'une chaîne du froid.
La structure CryoEM du LCB3 correspond au modèle conçu de novo avec une précision atomique. Le modèle de calcul (gris argenté) du complexe LCB3 / RBD est recouvert de sa structure CryoEM (cyan pour RBD et rose clair pour LCB3). Les détails d'interaction de l'interface sont affichés à partir de 4 vues différentes (A-D). Les interactions polaires sont mises en évidence par des lignes pointillées en orange pour la structure CryoEM et en jaune pour le modèle de conception. Les indices de résidus représentatifs sont étiquetés selon le PDB 6M0J.
Modélisation structurelle du complexe Minibinder-RBD
L'évaluation structurale a montré que LCB1 et LCB3 ancrés à la RBD au motif de liaison au récepteur (RBM), qui forme une petite ouverture. Ces deux molécules se lient à des orientations opposées en utilisant de nombreuses interactions électrostatiques, ainsi qu'en profitant de formes complémentaires dans deux des hélices alpha des mini-liants. Les sites qui se lient à ces deux molécules sont enterrés lorsque la protéine S est en conformation fermée. Ce n’est que si deux ou plusieurs RBD sont à l’état «up» que les trois sites de liaison peuvent être reconnus en même temps.
Ces mini-liants forment à la fois de nombreux ponts salins et des liaisons hydrogène avec le RBM, qui est responsable des affinités élevées à moins de nanomoles du RBD. Ces deux molécules ont des sites de liaison sur la protéine de pointe qui chevauchent le site de liaison de ACE2, permettant une inhibition compétitive de la liaison du virus à la surface de la cellule hôte.
Les structures cryoEM ont été comparées aux modèles conçus, montrant des correspondances proches dans l'état lié et confirmant la majorité des liaisons polaires observées. Ainsi, la précision de cette méthode basée sur la conception informatique de production d'inhibiteurs de haute affinité est confirmée, avec de très fines variations sous la forme de substitutions qui améliorent l'affinité.
Affinité picomolaire, activité neutralisante
Les mini-liants produits par les deux approches ont montré une puissante activité neutralisante contre le SARS-CoV-2, mais le LCB1-5 avait une neutralisation encore plus puissante que la première approche. La CI50 était de 35 nM et 35-48 pM pour les mini-liants de première et seconde approche, respectivement.
Les chercheurs soulignent: «Sur une base molaire, ces valeurs sont environ 6 fois inférieures à celles de l'anticorps monoclonal anti-SRAS-CoV-2 le plus puissant décrit à ce jour (13); sur une base de masse, en raison de leur très petite taille, les dessins sont plus puissants que n'importe lequel de ces anticorps. » En fait, chaque mini-liant ne fait qu'un vingtième de la taille d'une molécule d'anticorps complète, leur permettant de se lier à 20 fois plus de sites neutralisants et conférant ainsi une efficacité beaucoup plus élevée.
Production rentable et évolutive
Enfin, le coût et la facilité de production évolutive sont bien améliorés avec ces molécules plus simples, qui n'ont pas besoin d'être exprimées dans des cellules de mammifères pour que le repliement correct des protéines ait lieu, contrairement aux anticorps. Étant de petites molécules stables, il devrait être facile de les incorporer dans un gel nasal, une solution de nébulisation ou une poudre sèche. De plus, ils peuvent ne pas induire de réaction immunitaire, comme cela a été observé avec d'autres petites protéines conçues de novo, en raison de leur petite taille, de leur stabilité élevée et de leur bonne solubilité qui empêche les cellules dendritiques de les présenter comme des antigènes.
Directions futures
La rapidité de développement de ces modèles est frappante, d'ici 6 mois. Les chercheurs prévoient des flux de travail encore plus rapides à mesure que les travaux se poursuivent sur cette trajectoire. Cela serait dû à plusieurs raisons: des méthodes plus précises de prédiction de la structure, qui pourraient permettre de créer des modèles de conception dans la journée suivant la découverte de la structure du génome d'un nouveau pathogène.
Le flux de travail peut être désencombré pour se concentrer sur l'identification des candidats optimaux avec les meilleures substitutions pour une affinité accrue. En effet, le cryoEM s'accorde bien avec la conception informatique, montrant qu'il est relativement facile de concevoir avec précision des mini-liants protéiques avec une forme complémentaire et une séquence chimique.
Les chercheurs prédisent: «Avec le développement continu des méthodes, nous pensons qu'il deviendra possible de générer des conceptions neutralisant les pathogènes à très haute affinité dans les semaines suivant l'obtention de la séquence du génome.» Ce serait un atout inestimable pour se préparer à de futures pandémies causées par de nouveaux agents pathogènes.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.
