Dans une étude récente publiée dans iScienceles chercheurs ont conçu des nanocorps biparatopiques contre le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Arrière plan
Malgré le développement rapide de vaccins efficaces et sûrs contre le SRAS-CoV-2, les questions concernant leur efficacité à long terme prévalent, justifiant la poursuite de la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les produits biologiques protéiques recombinants tels que les anticorps monoclonaux (mAbs) présentent un potentiel pour la prophylaxie et le traitement des personnes infectées.
De plus, les nanocorps, des anticorps contenant un seul domaine variable, sont originaires de la famille des camélidés. La petite taille, la stabilité élevée et l’architecture simple des nanocorps sont avantageuses par rapport aux mAb conventionnels. Ceux-ci permettent une meilleure pénétration dans les tissus, avec une propension à la liaison de haute affinité aux petits épitopes. De plus, les nanocorps se prêtent à des liaisons covalentes pour l’amélioration de la fonction et ont généralement des rendements plus élevés et des coûts de production inférieurs.
L’étude et les conclusions
Dans la présente étude, les chercheurs ont isolé des nanocorps contre le domaine de liaison au récepteur (RBD) du pic SARS-CoV-2 à l’aide d’une bibliothèque d’affichage de levure synthétique. Les RBD ont été conçus en deux formats – 1) monomère RBD avec une étiquette AVI pour la biotinylation et 2) RBD-Fc dimère, dans lequel le RBD a été fusionné avec le domaine cristallisable (Fc) du fragment d’IgG1 de souris.
Les sondes RBD ont été validées en transfectant de manière transitoire des cellules 293T avec l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) et colorées avec des monomères RBD tétramérisés. Les auteurs ont noté une liaison ACE2-dépendante des sondes RBD aux cellules 293T, validant leur intégrité fonctionnelle. Ces tétramères ont été utilisés pour générer des nanocorps neutralisants spécifiques à RBD à partir d’une bibliothèque d’affichage de levure.
La sélection a impliqué deux étapes successives d’enrichissement magnétique, suivies d’un enrichissement basé sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), qui a abouti à une bibliothèque avec environ 72 % de clones de levure se liant à la RBD. Ensuite, la bibliothèque a été co-colorée avec des tétramères RBD de SARS-CoV-1 et SARS-CoV-2, qui ont révélé des populations distinctes.
Une population (majeure) a lié exclusivement les tétramères SARS-CoV-2 RBD, tandis que l’autre population (mineure) a lié les tétramères RBD des deux virus. Probablement, les clones à réaction croisée SARS-CoV-1/2 pourraient avoir un épitope RBD conservé, représentant une cible importante. Ensuite, les clones ont été triés sur une seule cellule et les 10 meilleurs clones avec la coloration tétramère RBD la plus brillante ont été séquencés.
Des vecteurs d’expression de mammifères ont été clonés avec l’ADN de nanocorps spécifiques à RBD, et les nanocorps ont été purifiés. Les auteurs ont testé si les nanocorps purifiés inhibaient l’interaction ACE2-RBD à l’aide d’un test de neutralisation du virus de substitution (sVNT) et ont trouvé quatre clones de nanocorps (A11, B1, C8 et G8) qui inhibaient la liaison. Il convient de noter que seul le nanocorps G8 était réactif de manière croisée avec le SARS-CoV-1/2.
La capacité de liaison RBD des clones de nanocorps a été évaluée à l’aide de la résonance plasmonique de surface (SPR). Les quatre nanobodies ont lié le SARS-CoV-2 RBD avec des affinités modérées, tandis que seul le G8 a lié le SARS-CoV-1 RBD, bien qu’avec une affinité réduite. D’autres expériences basées sur la SPR ont révélé deux modes de liaison distincts – l’un impliquait la liaison à un épitope partagé (pour les constructions A11, B1 et C8) et l’autre à un épitope différent (G8) qui était plus conservé dans le SARS-CoV-1 RDB.
Bien que les nanocorps aient présenté des affinités modérées, il était peu probable qu’ils neutralisent fortement l’infection par rapport aux multiples mAb de haute affinité utilisés. Par conséquent, les chercheurs ont généré une série de constructions de nanocorps pour augmenter la capacité de neutralisation des monomères de nanocorps. Les clones de nanocorps avec les affinités les plus élevées (G8 et B1) ont été utilisés. Ces expériences d’amélioration impliquaient trois stratégies différentes.
Tout d’abord, un domaine IgG1 Fc humain a été fusionné aux nanocorps (constructions B1-Fc et G8-Fc). Deuxièmement, B1 et G8 ont été joints de manière covalente (constructions biparatopiques) via un lieur glycine-sérine (GS). Les constructions biparatopiques (BP) ont été générées avec trois longueurs de lieur différentes (10, 19 et 39 acides aminés). Troisièmement, des constructions dimères biparatopiques ont été générées à l’aide de domaines IgG1 Fc humains. Un test de microneutralisation a été effectué pour tester si les constructions inhibaient l’infection par le SRAS-CoV-2.
En tant que monomères, B1 et G8 ont modérément inhibé l’infection ; cependant, la dimérisation Fc de l’un ou l’autre des nanocorps a amélioré leur activité neutralisante. Notamment, les constructions monomériques biparatopiques ont nettement amélioré la neutralisation, augmentant avec la longueur du lieur. La dimérisation Fc des constructions biparatopiques a entraîné une puissante activité neutralisante; cependant, ils étaient moins efficaces que leurs homologues monomères.
De plus, les nanocorps biparatopiques ont été testés à l’aide d’un réseau de variantes multiplex RBD pour évaluer leur capacité à surmonter l’évasion virale. La liaison des nanocorps aux RBD des variants préoccupants du SRAS-CoV-2 (VOC) et l’inhibition de RBD-ACE2 ont été mesurées. La construction G8-Fc s’est liée à toutes les variantes testées avec une puissance élevée, mais le nanocorps B1-Fc a montré une liaison réduite aux variantes RBD bêta et gamma et à celles contenant des substitutions E484D, E484K, Q493K et S494P.
Néanmoins, le nanocorps biparatopique avec un lieur de 10 acides aminés (BP10) avait un profil similaire à G8-Fc. L’inhibition de l’interaction RBD-ACE2 a été testée dans un sVNT à base de billes en utilisant 20 RBD distincts, y compris ceux du SRAS-CoV-1, des coronavirus de chauve-souris et de pangolin, et les variantes Omicron BA.1 et BA.2.
Les résultats étaient similaires à ceux du réseau multiplex. Cependant, les constructions de nanocorps n’ont pas neutralisé les variantes d’Omicron. Enfin, les souris ont été traitées séparément avec les constructions B1-Fc, G8-Fc et BP10-Fc et provoquées avec le SARS-CoV-2 après 24 heures. Le traitement au G8-Fc a modérément diminué les charges virales dans les poumons. En revanche, les souris traitées avec B1-Fc ou BP10-Fc étaient entièrement protégées.
conclusion
En résumé, l’étude a démontré l’isolement de nanocorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide d’une bibliothèque d’affichage de levure et que la génération de nanocorps biparatopiques pourrait améliorer leur puissance neutralisante, apparemment en raison de la réticulation de protéines de pointe distinctes. Curieusement, la dimérisation des constructions biparatopiques n’a pas réussi à améliorer la neutralisation par rapport à leurs homologues monomères.
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