Dans une étude récente publiée sur le serveur de préimpression Place de la Recherche* en cours d’examen pour publication dans Epigénétique & Chromatine, les chercheurs développent et caractérisent un système d’EpiEditing hautement spécifique utilisant Cas9 inactivé catalytiquement (dCas9) pour obtenir une méthylation (ASM) de l’acide désoxyribonucléique (ADN) spécifique d’un allèle.
Étude: Développement de l’édition super-spécifique de l’épigénome par méthylation ciblée de l’ADN spécifique d’un allèle. Crédit d’image : Natali _ Mis / Shutterstock.com
*Avis important: Place de la recherche publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
Sommaire
Arrière-plan
L’édition épigénomique implique la reprogrammation précise de régions génomiques spécifiques à l’aide d’un outil appelé EpiEditor. EpiEditor se compose généralement de composants tels que dCas9, DNMT3A/3L et de l’acide ribonucléique (ARN) à guide unique (sgRNA). En introduisant la méthylation dans un locus particulier, l’expression des gènes peut être modulée.
L’ASM fait spécifiquement référence à la délivrance ciblée de la méthylation à un seul allèle d’un locus génomique. Dans le contexte de maladies causées par une mutation dominante, la méthylation sélective de l’allèle mutant pourrait être utilisée pour supprimer son expression tout en préservant la fonctionnalité du gène.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, un seul vecteur d’expression sgRNA a été construit en remplaçant une section du squelette du vecteur pMulti-sgRNA-LacZ-DsRed par la cassette d’expression sgRNA du vecteur AIO-mCherry.
Pour les cibles avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) dans la région du motif adjacent au protospacer (PAM), une séquence génomique de 20 nucléotides (nt) en amont du PAM a été sélectionnée comme site de liaison du sgRNA. Comparativement, pour les cibles avec des SNP dans la région de graine de l’ARNsg, une séquence de 20 nt en amont du PAM le plus proche contenant le SNP a été utilisée.
Les sgARN sélectionnés ont été évalués pour leur efficacité et leurs effets potentiels hors cible à l’aide de CRIPOR et de CCTop. La formation d’ADN quadruplex dans la région sgRNA a été analysée à l’aide de QGRS Mapper, tandis que le clonage des vecteurs d’expression sgRNA a été réalisé à l’aide de Golden Gate Assembly. De plus, la transfection de cellules HEK293 a été réalisée avec un mélange de dCas9-10x SunTag, scFv-DNMT3A/3L, et le vecteur d’expression multi-sgRNA.
Des marqueurs fluorescents ont été inclus dans chaque plasmide pour faciliter le tri des cellules triple positives. L’ADN génomique a été extrait, converti au bisulfite et soumis à la préparation d’une bibliothèque pour le séquençage de nouvelle génération (NGS).
L’analyse de la méthylation de l’ADN a également été réalisée à l’aide de Trim Galore!, PEAR, bwameth et MethylDackel. L’isolement de l’ARN et la synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc) ont été suivis d’une analyse de l’expression à l’aide d’amorces spécifiques au gène et de la génération d’une bibliothèque avec une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en deux étapes. Les ratios d’expression allélique ont été déterminés pour les gènes avec des SNP dans les exons.
Résultats de l’étude
Les cellules HEK293 ont été sélectionnées pour cette étude en raison de leur facilité de manipulation et de leur grande efficacité de transfection. Pour recueillir des données sur les SNP dans le génome, une base de données publique a été consultée. Les estimations initiales des niveaux de méthylation de l’ADN ont été obtenues à partir des données de séquençage MBD2-pulldown générées dans une étude précédente.
Un en silicone recherche a été menée pour identifier les SNP dans les CGI non méthylés (îlots CpG) situés dans les régions promotrices du gène. Les résultats de la recherche ont été filtrés en fonction de la présence de SNP à proximité du site PAM potentiel ou dans la région de graine d’un sgRNA prometteur. Quatorze gènes cibles avec des SNP appropriés ont été identifiés, avec jusqu’à trois sgARN conçus pour cibler chaque allèle de gène.
Les expériences ont été classées en fonction de l’emplacement du SNP dans l’ARNsg, y compris la région de graine, la position deux de la séquence PAM ou la position trois de PAM. Les SNP dans la région PAM conduisant au changement de guanine (G) en Y, où Y représente la cystéine (C) ou la taurine (T), ont été préférés, car ces changements présentaient la meilleure discrimination de scFv-DNMT3A/3L-sfGFP, dCas9-10x SunTag-BFP et les constructions sgRNA-DsRed dans les cellules HEK293. Des expériences de contrôle ont également été menées en utilisant un sgRNA brouillé sans site de liaison dans le génome humain.
L’impact de l’ASM sur les ratios d’expression génique spécifiques à l’allèle a également été déterminé. Les gènes avec des SNP dans les exons ont été sélectionnés et les taux d’expression allélique ont été déterminés.
L’ASM a entraîné des changements significatifs dans les rapports d’expression allélique pour les gènes ISG15-Seed2 et MRPL52-PAM3. Les chercheurs étaient également intéressés par le développement et la caractérisation de systèmes d’EpiEditing hautement spécifiques utilisant dCas9 pour réaliser l’ASM. Une version améliorée de DNMT3A/3L avec une activité non spécifique réduite a été utilisée comme partie catalytique et connectée au complexe sgRNA/dCas9 via le système SunTag pour l’amplification et la dimérisation du signal.
Les SNP hétérozygotes dans la région de graine de la région sgRNA ou PAM de dCas9 ont été ciblés pour obtenir une discrimination allélique. L’efficacité de la méthylation ciblée de l’ADN variait selon les cibles, les cibles les plus réussies atteignant une méthylation moyenne de l’ADN supérieure à 50 % sur des sites CpG sélectionnés.
Le succès de l’ASM a été évalué en fonction du niveau global d’ASM et du rapport de gain de méthylation de l’ADN sur les allèles cibles et hors cible. Les expériences ASM les plus réussies avaient le SNP placé dans la région PAM. La méthylation indésirable de l’ADN de l’allèle hors cible pourrait provenir soit de la liaison hors cible du complexe sgRNA/dCas9, soit de l’activité ciblée du DNMT3A/3L.
conclusion
Les chercheurs de l’étude actuelle ont réussi à méthyler l’ADN spécifique d’un allèle ciblé en utilisant des complexes sgRNA/dCas9 dans des cellules HEK293. Cette nouvelle approche a été associée à une spécificité, une efficacité et une stabilité élevées de la méthylation spécifique de l’allèle qui a généré des changements dans le rapport allélique de l’expression génique.
Pris ensemble, les résultats de l’étude démontrent le potentiel des complexes sgRNA/dCas9 pour l’édition d’épigénome spécifique d’allèle et leur applicabilité en médecine personnalisée.
*Avis important: Place de la recherche publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
