Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, des chercheurs aux Pays-Bas ont évalué la structure de l’immunoglobuline M (IgM) circulatoire humaine et sa relation avec la petite protéine de type antigène CD5 (CD5L). Ils ont également étudié le rôle de CD5L dans la liaison au récepteur Fc et l’activation du complément.
*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
L’IgM est un constituant essentiel de l’immunité médiée par les anticorps et est conservée malgré les processus évolutifs. Parmi les isotypes d’anticorps, l’IgM apparaît en premier lors des réponses immunologiques. L’immunoglobuline M est une molécule protéique multimère de grande taille (1,0 MDa), dont la structure a été rapportée comme étant pentamère ou hexamère, la première comprenant une chaîne de jonction (J).
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont redéfini la structure de l’IgM sérologique comme un pentamère complexé avec CD5L et comprenant une chaîne J.
L’équipe a caractérisé le CD5L et l’IgM en suivant les associations et les abondances des protéines dans les sérums obtenus de 42 donneurs sains. Pour déterminer la quantité des chaînes protéiques (Igµ, J et CD5L), une protéomique ascendante avec quantification sans étiquette a été réalisée. Ensuite, les sérums regroupés ont été soumis à une analyse MS par chromatographie d’exclusion de taille (SEC).
Des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) ont été effectués pour quantifier les complexes IgM-CD5L. La structure des IgM circulatoires a été analysée par photométrie de masse et spectrométrie de masse à détection de charge native (CD MS). Pour étudier la co-expression d’IgM et de CD5L parmi les lymphocytes B, des lymphocytes B mémoire et naïfs ont été cultivés et le surnageant d’IgM a été analysé.
Pour étudier les mécanismes de liaison IgM-CD5L, des CD5L recombinants (rCD5L) et des IgM-J pentamériques ont été produits in vitro. Pour évaluer le rôle des cystéines C191 et C300 dans la formation du complexe IgM-J-CD5L, des variants CD5L humains recombinants (hCD5L) ont été produits avec des cystéines mutées en sérines, et leurs capacités d’association IgM-J ont été évaluées. Des analyses de prédiction de structure ont également été effectuées.
En outre, les implications fonctionnelles de l’insertion de CD5L dans les IgM ont été étudiées à l’aide d’anticorps IgM monoclonaux recombinants spécifiques de la biotine et en évaluant leurs capacités à induire le dépôt du composant 3 du complément (C3b) et à provoquer la lyse des érythrocytes humains biotinylés.
Résultats
Les IgM circulatoires (sérologiques) existaient exclusivement sous la forme d’un complexe de pentamères contenant la chaîne J liés de manière covalente à la petite protéine CD5L (36,0 kDa) via CD5L-Cys191. En revanche, les IgM sécrétoires dans le lait et la salive manquaient de CD5L. Contrairement à l’IgM, le CD5L n’était pas sécrété par les lymphocytes B, indiquant que le CD5L était associé à l’IgM extracellulaire.
Les résultats ont indiqué que l’insertion de CD5L dans les IgM avait plusieurs conséquences fonctionnelles, c’est-à-dire qu’elle réduisait la liaison des IgM à deux récepteurs, le récepteur polymère des Ig (pIgR) et le FcαµR. En revanche, la liaison FcµR et le complément médicamenté par C1q ne semblaient pas affectés par l’intégration de CD5L et d’IgM. Le CD5L s’est produit de manière synchrone avec l’IgM en circulation. L’équipe a détecté une concentration sérologique moyenne de CD5L de 1,70 µM ou 60,0 mg/L.
Remarquablement, les niveaux de CD5L étaient fortement corrélés avec ceux de la région constante de la chaîne lourde d’IgM (IgµC), indiquant des niveaux élevés de complexes IgM-CD5L circulants. De plus, le rapport CD5L/IgµC était d’env. 0,2, près d’une molécule de CD5L par pentamère d’IgM. L’IgM circulatoire était principalement un pentamère lié à la chaîne J avec CD5L.
Les taux de CD5L liés aux IgM et d’IgM totaux étaient corrélés dans les échantillons sérologiques, indiquant que les IgM circulatoires existaient sous une forme complexe avec le CD5L. Dans tous les échantillons d’IgM circulatoires, des décalages correspondant étroitement à l’incorporation d’une molécule CD5L ont été observés dans un rapport 1:1:10 de CD5L:chaîne J:IgµC. Chaque molécule d’IgM était homogène en masse et avait un état oligomérique. Des associations IgM-rCD5L efficaces ont été observées dans des conditions légèrement réductrices, ce qui indique que les liaisons disulfure = CD5L et IgM sont essentielles pour la formation de complexes.
La formation de complexes IgM-CD5L a été vérifiée par le blindage de l’épitope CD5L par deux anticorps monoclonaux anti-CD5L (mAbs, 7E4 et 10D11) qui ne peuvent pas se lier aux IgM sérologiques. La substitution d’acides aminés C191S a nettement diminué la formation des complexes, alors que la substitution C300S ne l’a pas fait, indiquant que C191 peut être connecté à IgM par des liaisons disulfure. Le CD5L était positionné dans l’espace pentamérique IgM-Fc et le domaine du composant sécrétoire 3 (SRC3) était proximal à la jonction de la chaîne de jonction entre les boucles C- et N-terminales de la chaîne J.
SRC2 était situé au-dessus de la cloison séparant les domaines Fc-Cμ3 et Fc-Cμ4 du N-terminal de la chaîne J, positionnant C191 près d’un résidu cystéine 414 (Cys414) non apparié d’IgM, et SRC1 était flexible. CD5L-J-IgM a activé de manière équivalente le complément, et les anticorps rIgM-J, avec ou sans CF5L, ont induit une lyse cellulaire et un dépôt de C3b en quantités comparables. De même, l’étude des effets de CD5L sur le dépôt du composant 3 du complément à l’aide d’anticorps monoclonaux qui se lient au Staphylococcus aureus paroi cellulaire-glycopolymère, l’acide teichoïque a donné des résultats similaires.
Sur la base des résultats de l’étude, la forme canonique de l’IgM sérologique humaine est un pentamère lié à la chaîne J avec une molécule de la protéine CD5L.
Professeur Albert JR Heck
Nous avons contacté l’auteur principal, le professeur Albert JR Heck de l’Université d’Utrecht, pour commentaires.
Parfois, en science, vous trouvez quelque chose de si évident que vous vous demandez pourquoi personne ne l’a vu auparavant ? Vous travaillez avec votre laboratoire sur cette découverte pendant des années pour vous assurer de ne pas vous tromper, mais ensuite vous entendez qu’un collègue lié d’amitié a indépendamment fait la même découverte. Nous avons commencé à travailler ensemble et avons généré des données biochimiques, biophysiques, structurelles et fonctionnelles complémentaires. Nous sommes maintenant prêts à le partager. Le titre dit tout : CD5L est un composant canonique des IgM circulatoires !
L’IgM est l’une des immunoglobulines clés et abondantes dans notre sang et joue un rôle dominant dans notre réponse immunitaire. En contraste frappant avec des décennies de connaissances théoriques sur sa structure, nous définissons la protéine CD5L comme un composant omniprésent des IgM sériques humaines.
Contrairement à l’IgM et à la chaîne J, le CD5L n’est pas produit par les lymphocytes B, ce qui implique qu’il s’associe à l’IgM dans l’espace extracellulaire. Nous démontrons également que l’intégration de CD5L a des implications fonctionnelles, c’est-à-dire qu’elle diminue la liaison des IgM à deux de ses récepteurs, le FcαµR et le récepteur polymère d’immunoglobuline (pIgR).
Ces découvertes sont d’un grand intérêt fondamental, mais comme l’IgM est de plus en plus développée en tant que thérapeutique, nous pensons que nos découvertes devraient également avoir un impact sur le domaine biopharmaceutique. – Professeur Albert JR Heck
*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
