Chaque plante, chaque animal et chaque personne sont un microcosme riche de minuscules cellules spécialisées. Ces cellules sont des mondes à part entière, chacune dotée de ses propres parties et processus uniques qui échappent à l'œil nu. Pouvoir observer le fonctionnement interne de ces éléments de construction microscopiques à une résolution nanométrique sans endommager leurs organites délicats a été un défi, mais des scientifiques de différentes disciplines du laboratoire national de Brookhaven du département américain de l'énergie (DOE) ont trouvé un moyen efficace d'imager une seule cellule en utilisant plusieurs techniques. Le processus fascinant de capture de ces images a été publié dans Biologie des communications.
La compréhension des structures internes des cellules, de la manière dont les produits chimiques et les protéines interagissent à l’intérieur de celles-ci et de la manière dont ces interactions signalent certains processus biologiques à une résolution nanométrique peut avoir des implications importantes en médecine, en agriculture et dans de nombreux autres domaines importants. Ces travaux ouvrent également la voie à de meilleures techniques d’imagerie biologique et à de nouveaux instruments pour optimiser l’imagerie biologique.
L'étude des cellules humaines et des organites qu'elles contiennent est passionnante, mais il existe de nombreuses possibilités de bénéficier de notre approche multimodale qui combine la tomodensitométrie à rayons X durs et l'imagerie par fluorescence X. Nous pouvons étudier des champignons pathogènes ou des bactéries bénéfiques. Nous sommes en mesure d'observer non seulement la structure de ces micro-organismes, mais également les processus chimiques qui se produisent lorsque les cellules interagissent de différentes manières.
Qun Liu, biologiste structural au laboratoire Brookhaven
Retirer l'un des éléments constitutifs de la vie
Avant même de commencer à réaliser l’imagerie, les chercheurs ont dû relever un défi majeur : préparer l’échantillon lui-même. L’équipe a décidé d’utiliser une cellule de la lignée HEK 293. Ces cellules sont connues pour être faciles à cultiver, mais difficiles à mesurer aux rayons X. Même si elles sont très petites, les cellules sont très sensibles aux dommages induits par les rayons X.
Les scientifiques ont suivi un processus minutieux en plusieurs étapes pour rendre l'échantillon plus robuste. Ils ont utilisé du paraformaldéhyde pour préserver chimiquement la structure de la cellule, puis ont fait congeler rapidement les échantillons par un robot en les plongeant dans de l'éthane liquide, les ont transférés dans de l'azote liquide et enfin les ont lyophilisés pour éliminer l'eau tout en préservant la structure cellulaire. Une fois ce processus terminé, les chercheurs ont placé les cellules lyophilisées sous un microscope pour les localiser et les étiqueter en vue d'une imagerie ciblée.
Avec un diamètre de seulement 12 à 15 microns (l'épaisseur moyenne d'un cheveu humain est de 150 microns), la préparation de l'échantillon pour les mesures n'a pas été facile, en particulier pour les mesures sur différentes lignes de faisceau. L'équipe devait s'assurer que la structure de la cellule pourrait survivre à plusieurs mesures avec des rayons X à haute énergie sans dommage significatif et que la cellule pourrait être maintenue de manière fiable au même endroit pour plusieurs mesures. Pour surmonter ces obstacles, les scientifiques ont créé des porte-échantillons standardisés à utiliser sur plusieurs équipements et ont mis en œuvre des microscopes optiques pour trouver et imager rapidement la cellule et minimiser l'exposition prolongée aux rayons X qui pourraient l'endommager.
Mesures multimodales
L'équipe a utilisé deux techniques d'imagerie trouvées à la National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) -; une installation utilisateur du DOE Office of Science à Brookhaven -; la tomodensitométrie à rayons X (XCT) et la microscopie à fluorescence X (XRF).
Les chercheurs ont recueilli des données XCT, qui utilisent les rayons X pour renseigner les scientifiques sur la structure physique de la cellule, sur la ligne de faisceau Full Field X-ray Imaging (FXI). La tomographie utilise les rayons X pour montrer une coupe transversale d'un échantillon solide. Un exemple connu est la tomodensitométrie, que les médecins utilisent pour imager des coupes transversales de n'importe quelle partie du corps.
Les chercheurs ont recueilli des données de microscopie XRF, qui fournissent davantage d’indices sur la distribution des éléments chimiques dans la cellule, sur la ligne de faisceau SRX (spectroscopie à rayons X à résolution submicronique). Dans cette technique, les chercheurs dirigent des rayons X à haute énergie sur un échantillon, excitant le matériau et le faisant émettre une fluorescence X. L’émission de rayons X a sa propre signature unique, permettant aux scientifiques de savoir exactement de quels éléments l’échantillon est composé et comment ils sont distribués pour remplir leurs fonctions biologiques.
« Nous avons été motivés à combiner l'imagerie XCT et XRF en raison des informations uniques et complémentaires que chacune d'elles fournit », a déclaré Xianghui Xiao, responsable scientifique de la ligne de faisceau FXI. « La fluorescence nous donne de nombreuses informations utiles sur les oligo-éléments à l'intérieur des cellules et sur la façon dont ils sont distribués. Il s'agit d'informations très importantes pour les biologistes. Obtenir une carte de fluorescence haute résolution sur de nombreuses cellules peut toutefois prendre beaucoup de temps. Même pour une simple image 2D, cela peut prendre plusieurs heures. »
C'est là qu'il est utile d'obtenir une image 3D de la cellule à l'aide de la technologie XCT. Ces informations peuvent aider à orienter les mesures de fluorescence vers des emplacements d'intérêt spécifiques. Cela permet aux scientifiques de gagner du temps, d'augmenter le rendement et de garantir que l'échantillon n'a pas besoin d'être exposé aux rayons X aussi longtemps, ce qui atténue les dommages potentiels causés à la cellule fragile.
« Cette approche corrélative fournit des informations utiles et complémentaires qui pourraient faire progresser plusieurs applications pratiques », a fait remarquer Yang Yang, scientifique spécialiste de la ligne de faisceau au SRX. « Pour quelque chose comme l'administration de médicaments, des sous-ensembles spécifiques d'organites peuvent être identifiés, puis des éléments spécifiques peuvent être tracés au fur et à mesure de leur redistribution au cours du traitement, ce qui nous donne une image plus claire de la manière dont ces produits pharmaceutiques fonctionnent au niveau cellulaire. »
Bien que ces avancées en imagerie aient permis d'avoir une meilleure vision du monde cellulaire, il reste encore des défis à relever et des moyens d'améliorer encore l'imagerie. Dans le cadre du projet NSLS-II Experimental Tools III – un plan visant à construire de nouvelles lignes de lumière pour fournir à la communauté des utilisateurs de nouvelles capacités -, Yang est responsable scientifique de l'équipe travaillant sur la prochaine ligne de lumière de tomographie cellulaire quantitative (QCT), qui sera dédiée à la bio-imagerie. QCT est une ligne de lumière de tomographie à rayons X mous à champ complet pour l'imagerie de cellules congelées avec une résolution à l'échelle nanométrique sans nécessiter de fixation chimique. Cette ligne de lumière de tomographie à rayons X mous cryogénique sera complémentaire aux méthodes actuelles, fournissant encore plus de détails sur la structure et les fonctions cellulaires.
Découvertes futures
Bien qu’il soit fascinant de pouvoir observer les cellules qui composent les systèmes du corps humain, être capable de comprendre les agents pathogènes qui attaquent et perturbent ces systèmes peut donner aux scientifiques un avantage dans la lutte contre les maladies infectieuses.
« Cette technologie nous permet d’étudier l’interaction entre un pathogène et son hôte », explique Liu. « Nous pouvons observer le pathogène et une cellule saine avant l’infection, puis les imager pendant et après l’infection. Nous remarquerons des changements structurels à la fois chez le pathogène et chez l’hôte et nous comprendrons mieux le processus. Nous pouvons également étudier l’interaction entre les bactéries bénéfiques du microbiome humain ou les champignons qui entretiennent une relation symbiotique avec les plantes. »
Liu travaille actuellement avec des scientifiques d'autres laboratoires nationaux et universités pour le programme de recherche biologique et environnementale du DOE afin d'étudier les interactions moléculaires entre le sorgho et Colletotrichum sublineola, Le sorgho est un champignon pathogène qui provoque l'anthracnose, une maladie qui peut endommager les feuilles des plantes. Le sorgho est une importante culture bioénergétique du DOE et la cinquième céréale la plus importante au monde. L'humanité aurait donc beaucoup à gagner en comprenant les tactiques de ce champignon dévastateur et la façon dont les défenses du sorgho fonctionnent aux niveaux cellulaire et moléculaire.
La capacité à voir à cette échelle peut donner aux scientifiques un aperçu des guerres que se livrent les agents pathogènes contre les cultures, l'environnement et même le corps humain. Ces informations peuvent aider à développer les bons outils pour combattre ces envahisseurs ou réparer les systèmes qui ne fonctionnent pas de manière optimale à un niveau fondamental. La première étape consiste à être capable de voir un monde que les yeux humains ne sont pas capables de voir, et les progrès de la science synchrotron se sont révélés être un outil puissant pour le découvrir.
Ce travail a été soutenu par le financement du laboratoire de recherche et développement dirigé par Brookhaven et par le Bureau des sciences du DOE.
