Dans une récente étude publiée sur Place de la Recherche*, les chercheurs ont développé une technique de diagnostic basée sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées groupées (CRISPR) pour détecter l’acide ribonucléique (ARN) du coronavirus-2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère.
Sommaire
Arrière-plan
Bien que les tests quantitatifs de réaction en chaîne par polymérase (qPCR) soient robustes et considérés comme l’étalon-or pour la détection des acides nucléiques, ils nécessitent un personnel qualifié, un équipement sophistiqué, une manipulation efficace des échantillons et de longs délais d’exécution.
Bien que cela puisse être acceptable pour de nombreuses autres applications de diagnostic, la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a révélé un besoin pressant de développer des diagnostics faciles à distribuer, simples à réaliser et rapides. Bien que ces facteurs soient traités par des tests antigéniques rapides (RAT) et des méthodes d’amplification isotherme, plusieurs limitations existent liées à leur sensibilité, spécificité ou polyvalence. Les diagnostics guidés par l’ARN CRISPR sont des technologies naissantes qui peuvent répondre aux limitations actuelles.
L’étude et les conclusions
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé un diagnostic basé sur CRISPR pour la capture et la concentration spécifiques à la séquence de l’ARN du SRAS-CoV-2 à partir d’échantillons hétérogènes.
Les complexes guidés par l’ARN CRISPR de type III tels que Cmr et Csm se lient à l’ARN complémentaire simple brin (ss) et le coupent. Un mutant (D34A), ribonucléase (RNase)-complexe CRISPR de type III-A mort (Csm3) de Thermus thermophile (TtCsmCsm3-D34A) a été mélangé et incubé avec du (32Phosphore ou 32P) ARN cibles et non cibles pour augmenter la sensibilité et tester s’il peut concentrer des ARN spécifiques à la séquence. Ils ont observé que la plupart (76 ± 5,8 %) des 32L’ARN cible marqué au P a été capturé par le complexe, tandis que l’ARN non cible a été concentré dans le surnageant. Ils ont également découvert que la concentration d’ARN à base de CRISPR de type III augmentait les niveaux d’oligoadénylates cycliques, cA3 et CA4.
De plus, un autre système CRISPR de type III (TtCsm6), activé par cA4, a été précédemment réutilisé pour la lecture fluorescente en temps réel pour détecter l’ARN viral. On a émis l’hypothèse que l’augmentation de cA4 les niveaux médiés par l’enrichissement en ARN à base de Csm pourraient stimuler l’activité de TtCsm6, améliorant ainsi la sensibilité. À cette fin, l’ARN (cible) du gène de la nucléocapside (N) du SRAS-CoV-2 a été titré dans l’ARN total (non cible) isolé des cellules HEK 293T pour TtCsmCsm3-D34Abasée sur la concentration d’ARN cible et ensuite transférée dans un mélange réactionnel de TtCsm6 et d’ARN rapporteur fluorescent. L’enrichissement de l’ARN à base de Csm a multiplié par 100 la sensibilité du test, démontrant que les complexes CRISPR de type III-A pouvaient capturer des ARN spécifiques à la séquence, augmenter les niveaux de nucléotides cycliques et améliorer la sensibilité de la détection de l’ARN.
Les domaines CARF (Rossman fold) associés à CRISPR dans certaines protéines de la famille Csm forment des homodimères et se lient à cA4 ou CA6, activation du domaine de liaison aux nucléotides des eucaryotes et des procaryotes supérieurs (HEPN). Pourtant, dans certaines protéines Csm6, le domaine CARF dégrade le nucléotide cyclique inactivant la nucléase.
Pour surmonter cette limitation, ils ont exploré les nucléases CARF qui ne dégradent pas cA4. L’équipe a testé l’activité nucléase de la nucléase auxiliaire CRISPR 1 (Can1) de T. thermophilus (TtCan1) contre le plasmide désoxy-ARN (ADN) en présence de cinq oligoadénylates cycliques et une dégradation robuste observée avec cA3 et les ions manganèse (Mn+2). Une enquête plus approfondie a révélé que TtCan1 était une désoxyribonucléase (DNase) double brin (ds) sans aucune spécificité de séquence lorsqu’elle était activée par cA3 et ssRNase si activé par cA4. De même, Can2 de Archéoglobes l’archéon JdFR-42 (AaCan2) s’est avéré être une dsDNase en présence de cA3 et Mn+2 et ssRNase en présence de cA4 et Mn+2 ou des ions magnésium (Mg+2).
Ensuite, les auteurs ont noté que TtCan1 et AaCan2 clivaient le même ARN synthétique, mais que le clivage médié par TtCan1 nécessitait des niveaux plus élevés de cA4 et a produit un signal fluorescent plus faible que AaCan2. Il a été constaté que AaCan2 induisait un signal fluorescent similaire à TtCsm6 lorsqu’il était activé par une quantité 20 fois moindre de cA4. Par conséquent, le couplage AaCan2 avec le TtCsmCsm3-D34A augmenté la sensibilité de la détection de l’ARN.
Enfin, des écouvillons nasopharyngés de 17 individus positifs pour le SRAS-CoV-2 et de six individus négatifs pour le SRAS-CoV-2 ont été testés pour voir si le complexe TtCsm pouvait capturer l’ARN extrait total. Les échantillons avec des niveaux élevés d’ARN viral, c’est-à-dire un seuil de cycle (Ct) > 17, étaient positifs avec la réaction TtCsm-AaCan2. Une augmentation de 100 fois de la sensibilité a été observée lorsque la méthode de capture d’ARN à base de Csm l’a complétée. De plus, il a été étudié si le complexe TtCsm pouvait capturer directement l’ARN des écouvillons sans extraction d’ARN. Le complexe TtCsm a détecté l’ARN lorsque des échantillons d’écouvillons ont été traités avec du Triton X-100 et de l’acide egtazique (EGTA) comme tampons de lyse dans un dosage fluorométrique basé sur TtCsm6. Enfin, cela a été testé avec le test TtCsm-AaCan2, qui a détecté 5 x 104 Copies d’ARN par microlitre.
Conclusion
Pour résumer, les chercheurs ont développé une technique pour capturer et concentrer l’ARN spécifique à la séquence à partir d’échantillons non traités à l’aide du TtCsm mort à la RNaseCsm3-D34A complexe. Cependant, la sensibilité de ce test reste comparable à la RAT et ne pourrait pas correspondre à celle des tests de diagnostic qPCR. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour appliquer les systèmes CRISPR de type III afin d’éliminer l’étape d’extraction de l’ARN, d’optimiser les tampons de lyse et de développer de nouvelles méthodes de lecture de nouvelle génération pour augmenter la sensibilité et raccourcir le délai d’obtention des résultats du test.
*Avis important
Research Square publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.