Une équipe de chercheurs dirigée par Anna-Karin Gustavsson de l'Université Rice a développé une plateforme d'imagerie innovante qui promet d'améliorer notre compréhension des structures cellulaires à l'échelle nanométrique. Cette plate-forme, appelée soTILT3D pour feuille de lumière inclinée à objectif unique avec fonctions de propagation de points 3D (PSF), offre des avancées significatives en microscopie super-résolution, permettant une imagerie 3D rapide et précise de plusieurs structures cellulaires tandis que l'environnement extracellulaire peut être contrôlé et ajusté de manière flexible. . La recherche a été récemment publiée dans Communications naturelles.
L’étude des cellules à l’échelle nanométrique fournit un aperçu des mécanismes complexes qui déterminent le comportement cellulaire, permettant ainsi aux chercheurs de découvrir des détails essentiels à la compréhension de la santé et des maladies. Ces détails peuvent révéler comment les interactions moléculaires contribuent aux fonctions cellulaires, ce qui est essentiel pour faire progresser les thérapies ciblées et comprendre la pathogenèse des maladies.
Bien que la microscopie à fluorescence conventionnelle ait été utile pour étudier les structures cellulaires, elle a été limitée par la diffraction de la lumière, limitant sa capacité à résoudre des caractéristiques inférieures à quelques centaines de nanomètres. De plus, bien que la microscopie à super-résolution monomoléculaire ait fourni des informations révolutionnaires sur les structures biologiques à l'échelle nanométrique, les techniques existantes souffrent souvent d'une fluorescence de fond élevée et de vitesses d'imagerie lentes, en particulier lorsqu'il s'agit d'échantillons épais ou d'agrégats cellulaires complexes. Ils manquent également généralement d’un contrôle précis et réglable de l’environnement de l’échantillon.
La plateforme soTILT3D répond directement à ces enjeux. En intégrant de manière synergique une feuille de lumière inclinée, un système microfluidique nano-imprimé et des outils informatiques avancés, soTILT3D améliore considérablement la précision et la vitesse de l'imagerie, permettant une visualisation plus claire de la manière dont les différentes structures cellulaires interagissent à l'échelle nanométrique – ; même dans des échantillons conventionnellement difficiles.
Clé nouveautés
La plate-forme soTILT3D utilise une feuille de lumière inclinée à objectif unique pour éclairer sélectivement de fines tranches d'un échantillon, améliorant ainsi efficacement le contraste en réduisant la fluorescence de fond des zones floues, en particulier dans les échantillons biologiques épais tels que les cellules de mammifères.
« La feuille de lumière est formée à l'aide du même objectif que celui utilisé dans le microscope pour l'imagerie, et elle est entièrement orientable, tramée pour éliminer les artefacts d'ombre courants dans la microscopie à feuille de lumière et inclinée pour permettre l'imagerie jusqu'à la lamelle, » a déclaré Gustavsson, professeur adjoint de chimie à Rice et auteur correspondant de l'étude. « Cela nous permet d'imager des échantillons entiers de haut en bas avec une précision améliorée. »
La plate-forme intègre également un système microfluidique conçu sur mesure avec un micromiroir métallisé personnalisable intégré, qui permet un contrôle précis de l'environnement extracellulaire et permet un échange rapide de solution, ce qui est idéal pour l'imagerie multicible séquentielle sans décalage de couleur tout en permettant également la réflexion de la lumière. feuille dans l’échantillon.
« La conception et la géométrie de la puce microfluidique et de l'insert nano-imprimé avec le micromiroir peuvent être facilement adaptées à divers échantillons et échelles de longueur, offrant ainsi une polyvalence dans différentes configurations expérimentales », a déclaré Nahima Saliba, co-premier auteur de l'article aux côtés de Gabriella, une autre étudiante diplômée. Gagliano, qui est également associé au Smalley-Curl Institute et au programme d'études supérieures en physique appliquée de Rice.
De plus, soTILT3D exploite des outils informatiques tels que l'apprentissage profond pour l'analyse de concentrations plus élevées de fluorophores afin d'améliorer la vitesse d'imagerie et des algorithmes pour la correction de dérive en temps réel, permettant une imagerie stable et de haute précision sur des périodes de temps prolongées.
L'ingénierie PSF de la plateforme permet l'imagerie 3D de molécules uniques, tandis que l'apprentissage profond gère les conditions d'émetteurs denses avec lesquelles les algorithmes conventionnels ont du mal, ce qui améliore considérablement la vitesse d'acquisition.
Nahima Saliba, Université Rice
Le dispositif microfluidique de SoTILT3D prend également en charge l'imagerie Exchange-PAINT automatisée, permettant de visualiser différentes cibles de manière séquentielle sans les décalages de couleurs courants dans les approches multicolores lors de l'imagerie en profondeur à l'échelle nanométrique.
Innovant résultats
La plateforme soTILT3D a démontré des améliorations remarquables en termes de précision et de vitesse d’imagerie. La feuille de lumière inclinée de la plate-forme améliore jusqu'à six fois le rapport signal/arrière-plan pour l'imagerie cellulaire par rapport aux méthodes d'épi-éclairage traditionnelles, améliorant ainsi le contraste et permettant une localisation précise à l'échelle nanométrique.
« Ce niveau de détail révèle des aspects complexes de l'architecture cellulaire 3D qui sont traditionnellement difficiles à observer avec les approches conventionnelles », a déclaré Gagliano.
En termes de vitesse, soTILT3D offre une vitesse décuplée lorsqu'elle est combinée à une densité d'émetteur élevée et à une analyse d'apprentissage profond, permettant aux chercheurs de capturer des images détaillées de structures complexes telles que la lame nucléaire, les mitochondries et les protéines de la membrane cellulaire dans des cellules entières en une fraction du temps habituel. . De plus, la plate-forme prend en charge une imagerie multicible 3D précise de cellules entières, capturant les distributions de plusieurs protéines dans une cellule entière et mesurant les distances à l'échelle nanométrique entre elles. Les chercheurs peuvent désormais visualiser la disposition spatiale de protéines étroitement situées comme les protéines de la lame nucléaire lamine B1 et lamine A/C et la protéine associée à la lame 2 avec une précision et une exactitude remarquables, offrant ainsi de nouvelles informations sur les organisations protéiques et leur rôle dans la régulation de la fonction cellulaire.
Large applications en biologie et en médecine
La plateforme soTILT3D ouvre de nouvelles possibilités aux chercheurs dans divers domaines. Sa capacité à imager des échantillons complexes, notamment des agrégats de cellules souches, étend son application au-delà des cellules individuelles. La biocompatibilité du système microfluidique le rend adapté à l'imagerie de cellules vivantes, permettant aux scientifiques d'étudier les réponses cellulaires à différents stimuli en temps réel avec des dommages photo réduits. Sa fonction d'échange de solution contrôlée avec précision fait également de soTILT3D un outil idéal pour tester l'impact des traitements médicamenteux sur les cellules en temps réel.
« Notre objectif avec soTILT3D était de créer un outil d'imagerie flexible qui surmonte les limites de la microscopie traditionnelle à super-résolution », a déclaré Gustavsson. « Nous espérons que ces progrès amélioreront les études en biologie, en biophysique et en biomédecine, où des interactions complexes à l'échelle nanométrique sont essentielles à la compréhension du fonctionnement cellulaire en matière de santé et de pathogenèse. »
