Dans une étude récente publiée sur le bioRxiv serveur de pré-impression*, une équipe de chercheurs a développé un vaccin contre la sous-unité 2 de la protéine de pointe du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2 S2), largement réactif et stable, capable de provoquer de fortes réponses en anticorps contre diverses souches de sarbecovirus, notamment celles à évolution rapide et variantes immuno-évasives.
Étude : Une stratégie de stabilisation largement généralisable pour les vaccins contre les machines de fusion des sarbecovirus. Crédit d’image : NIAID
*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ni être traités comme des informations établies.
Arrière-plan
En réponse à l’évolution du SRAS-CoV-2, les chercheurs ont créé un nouveau vaccin ciblant sa sous-unité S2. Cette stratégie se concentre sur la stabilisation de l’état de préfusion de la sous-unité, améliorant ainsi la réponse immunitaire. En conservant la structure des sous-unités et l’antigénicité du S2, ce vaccin s’avère efficace contre différents clades de sarbécovirus. Il a provoqué des réponses anticorps robustes lors de tests sur les animaux, principalement contre des variantes difficiles à résoudre telles que XBB.1.5. Bien que prometteuses, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour confirmer son efficacité chez l’homme et son efficacité à long terme contre les nouvelles variantes du SRAS-CoV-2.
À propos de l’étude
La présente étude a utilisé diverses lignées cellulaires, notamment des cellules de rein embryonnaire humain 293 avec l’antigène T SV40 (HEK293T), Expi293F et VeroE6-TMPRSS2. Ces cellules ont été cultivées dans des conditions de milieu spécifiques, mais n’ont pas été authentifiées ni testées pour la contamination par les mycoplasmes. L’accent était mis sur la production de protéines antigènes S2 recombinantes. À l’aide de cellules Expi293F, des transfections d’acide désoxyribonucléique (ADN) ont été réalisées, suivies d’un processus de récolte précis. Les protéines ont ensuite été purifiées à l’aide de techniques et d’équipements spécialisés, garantissant ainsi leur qualité pour des expériences ultérieures.
Les glycoprotéines HexaPro S du SARS-CoV-2 et du SARS-CoV-1 ont été produites selon des protocoles spécifiques dans des cellules Expi293F. Après transfection, les protéines ont subi une technique de purification similaire pour maintenir leur stabilité et leur utilisabilité.
Des tests ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays) ont été réalisés en utilisant des protéines soigneusement préparées et des protocoles spécifiques pour déterminer les valeurs EC50. Parallèlement, des cellules HEK293T ont été utilisées pour produire des pseudovirus du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) exprimant diverses constructions S. Ce processus fastidieux s’est déroulé en plusieurs étapes pour maintenir la qualité et l’efficacité des pseudovirus.
Des tests ELISA sérologiques ont également été réalisés, utilisant une approche systématique pour analyser l’immunogénicité de diverses protéines. De plus, l’étude a utilisé la microscopie électronique à coloration négative et la microscopie cryoélectronique pour une analyse structurelle détaillée, en suivant des protocoles rigoureux de préparation et de collecte de données. L’aspect immunogénicité a été examiné de manière approfondie au moyen d’expériences sur des souris BALB/c, selon des directives et des protocoles spécifiques. Cela comprenait des calendriers de vaccination détaillés et une collecte de sérum pour une analyse complète.
Enfin, des tests de neutralisation ont été réalisés en utilisant des cellules VeroE6-TMPRSS2 et divers pseudovirus. Cela impliquait une série d’étapes bien orchestrées pour mesurer avec précision la capacité de neutralisation des sérums, fournissant ainsi des informations essentielles sur l’efficacité des immunogènes. Les données de ces tests ont été soigneusement analysées pour déterminer les valeurs ID50, contribuant ainsi à la compréhension globale du potentiel des vaccins candidats.
Résultats de l’étude
L’équipe de recherche a précédemment conçu un antigène de machinerie de fusion (sous-unité S2) stabilisé en introduisant des mutations HexaPro spécifiques, un disulfure inter-protomère et un disulfure intra-protomère. Cette construction, nommée C-44, présentait une structure tertiaire de préfusion mais une structure quaternaire évasée et ouverte. Pour obtenir une structure quaternaire native dans le trimère de la sous-unité S2 de préfusion, ils ont sélectionné des mutations à partir d’un ensemble de données d’analyse de mutations profondes, en se concentrant sur les substitutions d’acides aminés stabilisatrices de préfusion. Des mutations individuelles, à savoir T961F, D994E et Q1005R, ont été introduites dans le fond C-44 et produites par recombinaison. Ces constructions présentaient une monodispersité et des rendements élevés en protéines purifiées.
La caractérisation par microscopie électronique (EM) a révélé que la mutation T961F (E-31) formait des trimères S2 fermés, contrairement à d’autres constructions qui adoptaient diverses conformations. La détermination de la structure CryoEM à une résolution de 2,7 Å a confirmé la structure fermée de préfusion de l’E-31, la substitution T961F renforçant les interactions au sommet de la machinerie de fusion. Bien qu’une fraction de trimères E-31 avec un sommet ouvert ait été détectée, la mutation a effectivement fermé le sommet dans une conformation préfusionnelle.
Une stratégie de stabilisation de préfusion largement généralisable pour la machinerie de fusion des sarbécovirus (S2 sous-unité) antigènes. UN, Diagrammes en ruban de S superposés2 sous-unités des structures de préfusion SARS-CoV-2 S (PDB 6VXX), SARS-CoV-1 S (PDB 5X58) et PRD-0038 S (PDB 8U29). Les mutations stabilisatrices de préfusion sont affichées en bleu (liaison disulfure intra-protomère), violet (liaison disulfure inter-protomère VFLIP), rouge (mutations portées de E-69) et vert (sous-ensemble de mutations proline sélectionnées dans HexaPro). BI, Vues agrandies du S superposé2 sous-unités des structures de préfusion SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 et PRD-0038 S mettant en évidence la conservation structurelle locale des résidus mutés dans SARS-CoV-2 E-69/F-53. Les résidus mutés dans nos constructions conçues sont soulignés. Le SARS-CoV-2, le SARS-CoV-1 et le PRD-0038 S sont respectivement représentés en gris clair, or et rose dans les panneaux (AI). J, Chromatogrammes d’exclusion de taille des modèles SARS-CoV-1 et PRD-0038 S conçus2 constructions, par rapport au SARS-CoV-2 F53. K, Rendements de purification des SARS-CoV-1 et PRD-0038 S conçus2 construit. Le rendement du meilleur SARS-CoV-2 S2 la construction (F53) est incluse à des fins de comparaison. L,M, Évaluation de la rétention de l’antigénicité pour le SARS-CoV-1 (L) et PRD-0038 (M) S2 antigènes dans diverses conditions de conservation grâce à la liaison des anticorps monoclonaux S2P6, 76E1 et RAY53 analysés par ELISA. NON, Évaluation de la rétention de la conformation native de préfusion du SARS-CoV-1 (N) et du PRD-0038 (O) S colorés négativement2 trimères après congélation/décongélation. Encarts : moyennes de classe 2D montrant une préfusion S compacte2 trimères. La barre d’échelle représente 50 nm (micrographies) et 200 Å (moyennes de classe 2D).
Pour améliorer l’homogénéité conformationnelle, des constructions supplémentaires comportant davantage de mutations ont été conçues. La construction E-60 contenait neuf mutations supplémentaires, mais sa structure cryoEM indiquait une distorsion dans une région de l’hélice α. Une nouvelle construction, E-69, a été conçue avec quatre mutations supplémentaires, résultant en un trimère de sous-unité S2 fermé par préfusion sans trimères apex ouverts, comme le confirme une structure cryoEM de résolution 3Å.
La rétention d’antigénicité a été testée dans diverses conditions de stockage pour évaluer la stabilité de la conception E-69. Les analyses ELISA et EM ont montré que l’E-69 conservait sa conformation de préfusion et son antigénicité inchangée, même après congélation et décongélation. Cette stabilité suggère la validité de la stratégie de stabilisation par préfusion, faisant du E-69 un candidat vaccin prometteur.
La large applicabilité de la stratégie de stabilisation par préfusion de la sous-unité S2 a ensuite été évaluée pour différents clades de sarbécovirus. Des constructions ont été conçues pour le SRAS-CoV-1 S2 et le PRD-0038 S2, incorporant des mutations de l’E-69. Ces constructions ont montré des rendements et une stabilité élevés, conservant leur antigénicité et adoptant l’architecture de préfusion fermée prévue.
L’immunogénicité du candidat vaccin E-69 a été testée chez des souris BALB/c avec différents schémas de vaccination. Les analyses ELISA ont montré des titres de liaison d’anticorps comparables contre les variantes du SRAS-CoV-2 et des titres plus élevés contre le SRAS-CoV-1. Les titres d’anticorps neutralisants étaient les plus élevés chez les souris E-69-vaccinées contre la variante XBB.1.5, démontrant le potentiel de ce vaccin à provoquer des réponses en anticorps largement réactives.
Enfin, pour évaluer l’efficacité protectrice in vivo, les souris ont été confrontées au variant XBB.1.5. Bien qu’aucun des vaccins n’ait empêché l’infection, les souris vaccinées étaient protégées contre la perte de poids et avaient des titres viraux comparables, ce qui suggère le potentiel du vaccin sous-unitaire S2 à protéger contre les variantes immunitaires évasives du SRAS-CoV-2.
*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ni être traités comme des informations établies.
