Dans une étude récente publiée dans ACS Science centraleles chercheurs ont utilisé un test de luminescence indépendant de la luciférase pour déterminer si la protéine Spike (S) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère de type sauvage (SRAS-CoV-2) possède une activité pseudo-luciférase pendant Cypridine luciférine.
Sommaire
Arrière-plan
La luciférine (substrat luminescent) et la luciférase (enzyme) sont essentielles à la détection de la bioluminescence (BL), permettant une détection par luminescence hautement sélective des protéines et des cellules cibles. La luciférine de type imidazopyrazinone (IPT) est présente dans de nombreuses espèces marines, alors que Cypridine la luciférase catalyse Cypridine luciférine et coelentérazine (CTZ). La luciférine émet de la lumière en présence de luciférase, bien qu’elle puisse réagir avec des protéines non luciférase ou d’autres biomolécules.
Une étude récente a montré que le dérivé HuLumino du CTZ peut détecter quantitativement l’albumine sérique humaine (HAS) avec une précision équivalente à un test immuno-enzymatique (ELISA) en moins d’une minute.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étudié l’application de Cypridine réaction de luminescence oxydative de la luciférine, catalysée par la protéine SARS-CoV-2 S, en biotechnologie. Ils ont rapporté que la protéine S du SRAS-CoV-2 avait une activité pseudo-luciférase contre Cypridine luciférine et étudié sa structure chimique et son activité de luminescence.
L’équipe a étudié les luciférines IPT pour l’émission de lumière en utilisant le monomère complet de la protéine SARS-CoV-2 S. Ils ont combiné 36 luciférines IPT, dont deux luciférines natives (CTZ et Cypridine luciférine) et 34 analogues CTZ précédemment connus, avec la protéine S. Utiliser les trois sous-unités de la protéine S [S1, S2, and receptor-binding domain (RBD)]l’équipe a détecté un potentiel Cypridine composants de luciférine. Ils ont comparé les profils cinétiques et ont dérivé les valeurs Km et Kcat relatives à partir des courbes d’ajustement de l’équation de Michaelis-Menten produites en utilisant l’intensité de luminescence de départ pendant 30 secondes.
L’équipe a étudié la connexion structure-activité de Cypridine analogues de luciférine (CLA) avec les glycoprotéines de pointe du SRAS-CoV-2 pour mieux comprendre les réactions de luminescence entre les Cypridine Substrat de luciférine et glycoprotéines SARS-CoV-2 S. Les groupes fonctionnels 3-indolyl et 3-(1-guanidino)propyl sont uniques à Cypridine luciférine et absent dans d’autres luciférines naturelles. Pour étudier les effets des groupes chimiques fonctionnels sur la luminescence enzymatique du SRAS-CoV-2 S, les chercheurs ont synthétisé trois types de CLA en remplaçant le groupe NH du 3-indolyle en C-6 de l’anneau ITP par un hétéroatome et en supprimant le 3-( Groupes fonctionnels 1-guanidino)propyle de C-8 en utilisant des procédures de synthèse.
L’équipe a exploré l’affinité de liaison de Cypridine luciférine à la protéine S en raison du groupe fonctionnel 3-(1-guanidino)propyle en C-8 à l’aide de simulations informatiques utilisant Autodock Vina. Ils ont également vérifié si une méthode de test basée sur la chimiluminescence (BCL) catalysant des biomolécules qui utilise l’activité pseudo-luciférase de la protéine S pourrait détecter la glycoprotéine trimérique de pointe du SRAS-CoV-2 dans un échantillon salivaire humain provenant d’une maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) Donneur négatif à la réaction en chaîne par polymérase (PCR) sans prétraitement de l’échantillon.
Résultats
La glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 a pu être identifiée dans la salive humaine à l’aide d’une méthode de test basée sur le BCL qui détecte la protéine de manière sélective et rapide sans nécessiter de prétraitement de l’échantillon. L’identification enzymatique du groupe fonctionnel 3-(1-guanidino)propyle dans la luciférine aux interfaces des unités protéiques S a conduit à la réponse de luminescence. L’approche BCL a le potentiel de compléter les tests centralisés de réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse (RT-PCR), qui nécessitent des installations cliniques spécialisées, des personnes formées et de longs délais de diagnostic.
Le SARS-CoV-2 S monomère a émis de la lumière en présence de luciférine Cypridina[rapportsignal/bruit(S/N)de35)plutôtqu’avecd’autresluciférinesLesrésultatsontindiquéquelaprotéineSARS-CoV-2Savaituneactivitépseudo-luciféraseetontdémontrélacapacitédecettetechnologieàcompléterlesapprochesdetestcentraliséesLacombinaisonorthogonaleappropriéedelaprotéinemonomèreSARS-CoV-2Set[signal-to-noise(S/N)ratioof35)ratherthanotherluciferinsThefindingsindicatedthattheSARS-CoV-2Sproteinhadpseudo-luciferaseactivityanddemonstratedtheabilityofthistechnologytosupplementcentralizedtestingapproachesTheappropriateorthogonalcombinationofthemonomericSARS-CoV-2SproteinandCypridine La luciférine a montré des réactions cinétiques de type flash, observées dans les systèmes bioluminescents utilisant la luciférine IPT, avec une baisse de l’intensité de luminescence d’environ 23 % sur une minute.
La luciférine IPT possède des groupes fonctionnels sec-2-butyle en C-2, 3-indolyl en C-6 et 3-(1-guanidino)propyle sur les sites C-8 du cycle ITP, révélant l’activité pseudo-luciférase du SRAS. -Glycoprotéine de pointe CoV-2. Cypridine La luciférine, une protéine de pointe monomère, a montré une efficacité plus élevée pour les réactions catalytiques que les protéines fragmentées, augmentant les valeurs de renouvellement enzymatique relatif (kcat) de plus de 2,6. Les unités individuelles peuvent ne pas contribuer à la luminescence de la luciférine mais plutôt aux sites de réaction créés lorsque les unités s’unissent. Le système de chimiluminescence, qui produit une luminescence dépendante de la luciférase dans les fluides polaires aprotiques, doit être classé comme BCL en fonction des intensités de luminescence.
Le Cypridine luciférase (Cluc) et Vargula La combinaison de luciférine a produit un rendement quantique bioluminescent de 30 %, le plus élevé de tous les systèmes BL à base de luciférine IPT, avec une spécificité de réaction. La technique basée sur la chimiluminescence catalysant les biomolécules identifie quantitativement le SRAS-CoV-2 S en utilisant une approche « mélanger et lire », qui consiste à ajouter la protéine luciférine au matériau et à surveiller le signal de luminescence pendant une minute. Cette approche détecte la protéine S plus rapidement et avec plus de précision que la méthode de test à flux latéral (LFA), qui utilise l’acide sialique liant la protéine S.
Conclusion
Les résultats de l’étude ont révélé une nouvelle méthode pour identifier les antigènes du SRAS-CoV-2 sans altérations génétiques ni anticorps. Les chercheurs pourraient quantifier l’activité pseudo-luciférase des glycoprotéines de pointe du SRAS-CoV-2 dans la salive humaine. La protéine S monomère brille de Cypridine luciférine, mais la protéine trimérique S a besoin de plus de luciférine. Le substituant 3-indolyle en C-6 et le groupe fonctionnel 3-(1-guanidino)propyle sont essentiels à l’activité de luminescence. La nouvelle technologie d’analyse des protéines peut détecter les protéines S dans la salive humaine en une minute sans préparation d’échantillon.
